ବର୍ତ୍ତମାନ *ବର୍ତ୍ତମାନ ଠିକଣା: କୋଲୋନ୍ 50931, ଜର୍ମାନୀ, କୋଲୋନ୍ ଏକ୍ସଲେନ୍ସ କ୍ଲଷ୍ଟର ରିସର୍ଚ୍ଚ ଅନ୍ ସେଲୁଲାର୍ ଷ୍ଟାସ୍ ରେସପନ୍ସ ଇନ୍ ଏଜିଂ-ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ରୋଗ (CECAD)।
ମାଇଟ୍କୋଣ୍ଡ୍ରିଆଲ ରୋଗର ନ୍ୟୁରୋଡିଜେନେରେସନକୁ ଅପରିବର୍ତ୍ତନୀୟ ବୋଲି ବିବେଚନା କରାଯାଏ କାରଣ ନ୍ୟୁରନର ମେଟାବୋଲିକ୍ ପ୍ଲାଷ୍ଟିସିଟି ସୀମିତ, କିନ୍ତୁ ଶରୀରରେ ନ୍ୟୁରୋନାଲ ମେଟାବୋଲିଜିମର କୋଷ ସ୍ୱାୟତ୍ତତା ଉପରେ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ ଡିସଫଙ୍କସନର ପ୍ରଭାବ ଖରାପ ଭାବରେ ବୁଝାଯାଏ। ଏଠାରେ, ଆମେ ବ୍ୟାହତ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ଗତିବିଧି ଯୋଗୁଁ ପ୍ରଗତିଶୀଳ OXPHOS ଅଭାବ ସହିତ ପୁରକିଞ୍ଜେ ନ୍ୟୁରନର କୋଷ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରୋଟିଓମକୁ ପରିଚୟ କରାଉଛୁ। ଆମେ ପାଇଲୁ ଯେ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ ଡିସଫଙ୍କସନ ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ସ କ୍ଷେତ୍ରରେ ଏକ ଗଭୀର ପରିବର୍ତ୍ତନ ଆଣିଥିଲା, ଯାହା ଶେଷରେ କୋଷ ମୃତ୍ୟୁ ପୂର୍ବରୁ ସଠିକ୍ ମେଟାବୋଲିକ୍ ପ୍ରୋଗ୍ରାମଗୁଡ଼ିକର କ୍ରମିକ ସକ୍ରିୟକରଣକୁ ନେଇଥିଲା। ଅପ୍ରତ୍ୟାଶିତ ଭାବରେ, ଆମେ ପାଇରୁଭେଟ୍ କାର୍ବୋକ୍ସିଲେଜ୍ (PCx) ଏବଂ TCA ଚକ୍ରର ମଧ୍ୟବର୍ତ୍ତୀ ଅଂଶଗୁଡ଼ିକୁ ପରିପୂରକ କରୁଥିବା ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ଆଣ୍ଟି-ଏଜିଂ ଏନଜାଇମର ସ୍ପଷ୍ଟ ପ୍ରେରଣା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିଥିଲୁ। PCx ର ନିରୋଧ ଅକ୍ସିଡେଟିଭ୍ ଚାପ ଏବଂ ନ୍ୟୁରୋଡିଜେନେରେସନକୁ ବୃଦ୍ଧି କରିଥିଲା, ଯାହା ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ OXPHOS ଅଭାବ ଥିବା ନ୍ୟୁରନରେ ଆଥେରୋସ୍ଲୋରୋସିସ୍ ର ଏକ ସୁରକ୍ଷାାତ୍ମକ ପ୍ରଭାବ ଅଛି। ଅନ୍ତିମ ଭାବରେ କ୍ଷୟ ହୋଇଥିବା ନ୍ୟୁରନରେ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ ଡିସଫ୍ୟୁଜନର ପୁନରୁଦ୍ଧାର ଏହି ମେଟାବୋଲିକ୍ ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟଗୁଡ଼ିକୁ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଭାବରେ ଓଲଟାଇଥାଏ, ଯାହା ଦ୍ଵାରା କୋଷ ମୃତ୍ୟୁକୁ ରୋକିଥାଏ। ଆମର ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକ ପୂର୍ବରୁ ଅଜଣା ପଥଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରେ ଯାହା ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ ଡିସଫଙ୍କସନକୁ ସ୍ଥିରତା ପ୍ରଦାନ କରେ ଏବଂ ଦର୍ଶାଏ ଯେ ରୋଗର ଶେଷ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ମଧ୍ୟ ନ୍ୟୁରୋଡିଜେନେରେସନକୁ ଓଲଟାଇ ଦିଆଯାଇପାରିବ।
ମାନବ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ ରୋଗ ସହିତ ଜଡିତ ବ୍ୟାପକ ସ୍ନାୟୁବିକ ଲକ୍ଷଣ ଦ୍ୱାରା ନ୍ୟୁରୋନାଲ୍ ଶକ୍ତି ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ ବଜାୟ ରଖିବାରେ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆର କେନ୍ଦ୍ରୀୟ ଭୂମିକା ଉପରେ ଗୁରୁତ୍ୱ ଦିଆଯାଇଛି। ଏହି ରୋଗଗୁଡ଼ିକ ମଧ୍ୟରୁ ଅଧିକାଂଶ ଜିନ୍ ମ୍ୟୁଟେକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ ଜିନ୍ ପ୍ରକାଶନକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରୁଥିବା (1, 2) କିମ୍ବା ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ ଗତିବିଧି ସହିତ ଜଡିତ ଜିନ୍ ନଷ୍ଟ ଦ୍ୱାରା ହୋଇଥାଏ, ଯାହା ପରୋକ୍ଷ ଭାବରେ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ DNA (mtDNA) (3, 4) ର ସ୍ଥିରତାକୁ ପ୍ରଭାବିତ କରେ। ପ୍ରାଣୀ ମଡେଲରେ କାର୍ଯ୍ୟ କରି ଦେଖାଯାଇଛି ଯେ ପାରିପାଶ୍ୱିକ ଟିସୁଗୁଡ଼ିକରେ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ ଡିସଫଂକ୍ସନର ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ, ରକ୍ଷଣଶୀଳ ମେଟାବୋଲିକ୍ ପଥ (5-7) ସକ୍ରିୟ ହୋଇପାରିବ, ଯାହା ଏହି ଜଟିଳ ରୋଗଗୁଡ଼ିକର ରୋଗଜନନକୁ ଗଭୀର ଭାବରେ ବୁଝିବା ପାଇଁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ସୂଚନା ପ୍ରଦାନ କରେ। ଏହାର ବିପରୀତରେ, ମସ୍ତିଷ୍କ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ ଆଡେନୋସାଇନ୍ ଟ୍ରାଇଫସଫେଟ୍ (ATP) ଉତ୍ପାଦନର ସାଧାରଣ ବିଫଳତା ଦ୍ୱାରା ହେଉଥିବା ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କୋଷ ପ୍ରକାରର ମେଟାବୋଲିକ୍ ପରିବର୍ତ୍ତନ ବିଷୟରେ ଆମର ବୁଝାମଣା ମୌଳିକ (8), ରୋଗକୁ ରୋକିବା କିମ୍ବା ପ୍ରତିରୋଧ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇପାରିବା ଚିକିତ୍ସାମୂଳକ ଲକ୍ଷ୍ୟଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରିବାର ଆବଶ୍ୟକତା ଉପରେ ଗୁରୁତ୍ୱାରୋପ କରେ। ନ୍ୟୁରୋଡିଜେନେରେସନ୍ (9) କୁ ରୋକିବା। ସୂଚନାର ଅଭାବ ହେଉଛି ଯେ ସ୍ନାୟୁ କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଆଖପାଖ ଟିସୁଗୁଡ଼ିକର କୋଷ ପ୍ରକାର ତୁଳନାରେ ବହୁତ ସୀମିତ ମେଟାବୋଲିକ୍ ନମନୀୟତା ଥିବା ଭାବରେ ବିବେଚନା କରାଯାଏ (10)। ଏହି କୋଷଗୁଡ଼ିକ ସିନାପ୍ଟିକ୍ ଟ୍ରାନ୍ସମିସନ୍ କୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରିବା ଏବଂ ଆଘାତ ଏବଂ ରୋଗ ପରିସ୍ଥିତିର ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପାଇଁ ନ୍ୟୁରନ୍‌କୁ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ଯୋଗାଣର ସମନ୍ୱୟ କରିବାରେ ଏକ କେନ୍ଦ୍ରୀୟ ଭୂମିକା ଗ୍ରହଣ କରୁଥିବାରୁ, ମସ୍ତିଷ୍କ ଟିସୁର ଚ୍ୟାଲେଞ୍ଜିଂ ପରିସ୍ଥିତି ସହିତ କୋଷ ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ କୁ ଗ୍ରହଣ କରିବାର କ୍ଷମତା ପ୍ରାୟ ଗ୍ଲିଆଲ୍ କୋଷ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ସୀମିତ (11-14)। ଏହା ସହିତ, ମସ୍ତିଷ୍କ ଟିସୁର ଅନ୍ତର୍ନିହିତ କୋଷୀୟ ବିଷମତା ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ନ୍ୟୁରୋନାଲ୍ ଉପଗୋଷ୍ଠୀରେ ଘଟୁଥିବା ମେଟାବୋଲିକ୍ ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡ଼ିକର ଅଧ୍ୟୟନକୁ ମୁଖ୍ୟତଃ ବାଧା ଦିଏ। ଫଳସ୍ୱରୂପ, ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ମାଇଟୋକୋଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଡିସଫଙ୍କସନ୍‌ର ସଠିକ୍ ସେଲ୍ୟୁଲାର୍ ଏବଂ ମେଟାବୋଲିକ୍ ପରିଣାମ ବିଷୟରେ ବହୁତ କମ୍ ଜଣାଯାଏ।
ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଡିସଫଙ୍କସନ୍‌ର ମେଟାବୋଲିକ୍ ପରିଣାମକୁ ବୁଝିବା ପାଇଁ, ଆମେ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ବାହ୍ୟ ଝିଲ୍ଲୀ ଫ୍ୟୁଜନ୍ (Mfn2) ନଷ୍ଟ ହେବା ଦ୍ୱାରା ସୃଷ୍ଟି ହୋଇଥିବା ନ୍ୟୁରୋଡିଜେନେରେସନ୍‌ର ବିଭିନ୍ନ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ପୁରକିଞ୍ଜେ ନ୍ୟୁରୋନ୍‌ (PNs)କୁ ପୃଥକ କରିଥିଲୁ। ଯଦିଓ ମଣିଷରେ Mfn2 ମ୍ୟୁଟେସନ୍‌ଗୁଡ଼ିକ Charcot-Marie-Tooth type 2A (15) ଭାବରେ ଜଣାଶୁଣା ବଂଶାନୁକ୍ରମିକ ମୋଟର ସେନ୍ସୋରୀ ନ୍ୟୁରୋପାଥି ସହିତ ଜଡିତ, ମୂଷାରେ Mfn2 ର ସର୍ତ୍ତମୂଳକ ବିନାଶ ହେଉଛି ଅକ୍ସିଡେସନ୍‌ର ଏକ ସୁପରିଚିତ ପ୍ରେରଣା ଫସ୍ଫୋରିଲେସନ୍ (OXPHOS) ଡିସଫଙ୍କସନ୍ ପଦ୍ଧତି। ବିଭିନ୍ନ ନ୍ୟୁରୋନାଲ୍ ଉପପ୍ରକାର (16-19) ଏବଂ ଫଳସ୍ୱରୂପ ନ୍ୟୁରୋଡିଜେନେରେଟିଭ୍ ଫେନୋଟାଇପ୍‌ ଗତି ବିକାର (18, 19) କିମ୍ବା ସେରେବେଲାର୍ ଆଟାକ୍ସିଆ (16) ଭଳି ପ୍ରଗତିଶୀଳ ସ୍ନାୟୁଗତ ଲକ୍ଷଣ ସହିତ ଥାଏ। ଲେବଲ୍-ଫ୍ରି କ୍ୱାଣ୍ଟିଟେଟିଭ୍ (LFQ) ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ସ, ମେଟାବୋଲୋମିକ୍ସ, ଇମେଜିଂ ଏବଂ ଭାଇରୋଲୋଜିକାଲ୍ ପଦ୍ଧତିଗୁଡ଼ିକର ମିଶ୍ରଣ ବ୍ୟବହାର କରି, ଆମେ ଦେଖାଉଛୁ ଯେ ପ୍ରଗତିଶୀଳ ନ୍ୟୁରୋଡିଜେନେରେସନ୍ ପାଇରୁଭେଟ୍ କାର୍ବୋକ୍ସିଲେଜ୍ (PCx) ଏବଂ ଭିଭୋରେ PNs ର ଆର୍ଟେରିଓସ୍କ୍ଲେରୋସିସ୍ ରେ ଜଡିତ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ କାରକଗୁଡ଼ିକୁ ଏନଜାଇମର ପ୍ରକାଶନରେ ଦୃଢ଼ ଭାବରେ ପ୍ରେରଣା ଦିଏ। ଏହି ସନ୍ଧାନର ପ୍ରାସଙ୍ଗିକତା ଯାଞ୍ଚ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ Mfn2-ଅଭାବୀ PNs ରେ PCx ର ପ୍ରକାଶନକୁ ବିଶେଷ ଭାବରେ ହ୍ରାସ କରିଥିଲୁ, ଏବଂ ପାଇଲୁ ଯେ ଏହି ଅପରେସନ୍ ଅକ୍ସିଡେଟିଭ୍ ଚାପକୁ ବୃଦ୍ଧି କରିଥିଲା ​​ଏବଂ ନ୍ୟୁରୋଡିଜେନେରେସନ୍କୁ ତ୍ୱରାନ୍ୱିତ କରିଥିଲା, ଏହିପରି ପ୍ରମାଣିତ କରିଥିଲା ​​ଯେ ଆଜୁସ୍ପର୍ମିଆ କୋଷ ମୃତ୍ୟୁକୁ ମେଟାବୋଲିକ୍ ଅନୁକୂଳନତା ପ୍ରଦାନ କରେ। MFN2 ର ଗମ୍ଭୀର ପ୍ରକାଶନ ଗୁରୁତର OXPHOS ଅଭାବ, ମାଇଟୋକୋଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ DNA ର ବିପୁଳ ବ୍ୟବହାର ଏବଂ ସ୍ପଷ୍ଟ ଭାବରେ ଭଙ୍ଗା ମାଇଟୋକୋଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ନେଟୱାର୍କ ସହିତ ଟର୍ମିନାଲ୍ ଡିଜେନେରେସନ୍ PN କୁ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଭାବରେ ଉଦ୍ଧାର କରିପାରିବ, ଯାହା ଆହୁରି ଜୋର ଦେଇଥାଏ ଯେ କୋଷ ମୃତ୍ୟୁ ପୂର୍ବରୁ ରୋଗର ଉନ୍ନତ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ମଧ୍ୟ ନ୍ୟୁରୋଡିଜେନେରେସନ୍ ର ଏହି ରୂପ ପୁନରୁଦ୍ଧାର ହୋଇପାରେ।
Mfn2 ନକଆଉଟ୍ PNs ରେ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆକୁ ଦୃଶ୍ୟମାନ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ଏକ ମାଉସ୍ ଷ୍ଟ୍ରେନ୍ ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ ଯାହା Cre-ନିର୍ଭରଶୀଳ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆକୁ ହଳଦିଆ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ ପ୍ରୋଟିନ୍ (YFP) (mtYFP) (20) Cre ପ୍ରକାଶନକୁ ଟାର୍ଗେଟ କରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ ଏବଂ ଭିଭୋରେ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଆକୃତି ଯାଞ୍ଚ କରିଥିଲୁ। ଆମେ ପାଇଲୁ ଯେ PNs ରେ Mfn2 ଜିନ୍ ନଷ୍ଟ ହେବା ଫଳରେ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ନେଟୱାର୍କ (ଚିତ୍ର S1A) ର ଧୀରେ ଧୀରେ ବିଭାଜନ ହେବ, ଏବଂ ପ୍ରଥମ ପରିବର୍ତ୍ତନ 3 ସପ୍ତାହ ବୟସରେ ମିଳିଲା। ବିପରୀତରେ, PN କୋଷ ସ୍ତରର ଯଥେଷ୍ଟ ଅବନତି, ଯେପରି କାଲବିଣ୍ଡିନ୍ ଇମ୍ୟୁନୋଷ୍ଟେନିଂର କ୍ଷତି ଦ୍ୱାରା ପ୍ରମାଣିତ, 12 ସପ୍ତାହ ବୟସ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଆରମ୍ଭ ହୋଇନଥିଲା (ଚିତ୍ର 1, A ଏବଂ B)। ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଆକୃତିରେ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ପରିବର୍ତ୍ତନ ଏବଂ ନ୍ୟୁରୋନାଲ୍ ମୃତ୍ୟୁର ଦୃଶ୍ୟମାନ ଆରମ୍ଭ ମଧ୍ୟରେ ସମୟ ଅସମାନତା ଆମକୁ କୋଷ ମୃତ୍ୟୁ ପୂର୍ବରୁ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଅକ୍ଷମତା ଦ୍ୱାରା ଆରମ୍ଭ ହୋଇଥିବା ମେଟାବୋଲିକ୍ ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡ଼ିକର ତଦନ୍ତ କରିବାକୁ ପ୍ରେରଣା ଦେଇଥିଲା। ଆମେ YFP (YFP+)-ପ୍ରକାଶକ PN (ଚିତ୍ର 1C) କୁ ପୃଥକ କରିବା ପାଇଁ ଏକ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ-ସକ୍ରିୟ କୋଷ ସର୍ଟିଙ୍ଗ (FACS)-ଆଧାରିତ ରଣନୀତି ବିକଶିତ କରିଛୁ, ଏବଂ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ମୂଷା (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), ଯାହାକୁ ପରେ CTRL (ଚିତ୍ର S1B) ଭାବରେ ଉଲ୍ଲେଖ କରାଯାଇଛି। YFP ସିଗନାଲର ଆପେକ୍ଷିକ ତୀବ୍ରତା ଉପରେ ଆଧାରିତ ଗେଟିଂ ରଣନୀତିର ଅପ୍ଟିମାଇଜେସନ୍ ଆମକୁ PNs ର YFP+ ଶରୀର (YFPhigh) କୁ ଅଣ-PNs (YFPneg) (ଚିତ୍ର S1B) କିମ୍ବା ପୁଟେଟିଭ୍ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ ଆକ୍ସନ/ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ଖଣ୍ଡ (YFPlow; ଚିତ୍ର S1D, ବାମ), କନଫୋକାଲ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ (ଚିତ୍ର S1D, ଡାହାଣ) ଦ୍ୱାରା ନିଶ୍ଚିତ କରି ଶୁଦ୍ଧ କରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ। ବର୍ଗୀକୃତ ଜନସଂଖ୍ୟାର ପରିଚୟ ଯାଞ୍ଚ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ LFQ ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ସ ଏବଂ ତା'ପରେ ପ୍ରମୁଖ ଉପାଦାନ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିଥିଲୁ, ଏବଂ ଜାଣିଲୁ ଯେ YFPhigh ଏବଂ YFPneg କୋଷ (ଚିତ୍ର S1C) ମଧ୍ୟରେ ଏକ ସ୍ପଷ୍ଟ ପୃଥକୀକରଣ ଅଛି। YFPhigh କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଜଣାଶୁଣା PNs ମାର୍କରଗୁଡ଼ିକର ନେଟ୍ ସମୃଦ୍ଧି ଦେଖାଇଲେ (ଯଥା Calb1, Pcp2, Grid2 ଏବଂ Itpr3) (21, 22), କିନ୍ତୁ ନ୍ୟୁରନ୍ କିମ୍ବା ଅନ୍ୟ କୋଷ ପ୍ରକାରରେ ସାଧାରଣତଃ ପ୍ରକାଶିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ର କୌଣସି ସମୃଦ୍ଧି ଦେଖାଗଲା ନାହିଁ (ଚିତ୍ର 1D)। ସ୍ୱାଧୀନ ପରୀକ୍ଷଣରେ ସଂଗୃହୀତ ବର୍ଗୀକୃତ YFPhigh କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ନମୁନା ମଧ୍ୟରେ ଏକ ତୁଳନା ଏକ ସହସଂବନ୍ଧ ଗୁଣାଙ୍କ> 0.9 ଦେଖାଇଲା, ଯାହା ଜୈବିକ ପ୍ରତିକୃତି ମଧ୍ୟରେ ଭଲ ପ୍ରଜନନଶୀଳତା ପ୍ରଦର୍ଶନ କରେ (ଚିତ୍ର S1E)। ସଂକ୍ଷେପରେ, ଏହି ତଥ୍ୟ ସମ୍ଭାବ୍ୟ PN ର ତୀବ୍ର ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବିଚ୍ଛିନ୍ନତା ପାଇଁ ଆମର ଯୋଜନାକୁ ବୈଧ କରିଥିଲା। କାରଣ ବ୍ୟବହୃତ L7-cre ଡ୍ରାଇଭର ସିଷ୍ଟମ ପ୍ରସବ ପରେ ପ୍ରଥମ ସପ୍ତାହରେ ମୋଜାଇକ୍ ପୁନଃସଂଯୋଗକୁ ପ୍ରେରଣା ଦିଏ (23), ଆମେ CTRL ରୁ ମୂଷାକୁ କାଟିବା ଆରମ୍ଭ କଲୁ ଏବଂ ସର୍ତ୍ତମୂଳକ (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) ନ୍ୟୁରନ୍ ସଂଗ୍ରହ କଲୁ। ପୁନଃସଂଯୋଗ ସମାପ୍ତ ହେବା ପରେ, ଏହାକୁ 4 ସପ୍ତାହ ବୟସରେ Mfn2cKO କୁହାଯାଏ। ଶେଷ ବିନ୍ଦୁ ଭାବରେ, ଆମେ 8 ସପ୍ତାହ ବୟସ ବାଛିଥିଲୁ ଯେତେବେଳେ PN ସ୍ତର ସ୍ପଷ୍ଟ ମାଇଟୋକୋଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ବିଖଣ୍ଡନ ସତ୍ତ୍ୱେ ଅକ୍ଷୁର୍ଣ୍ଣ ଥିଲା (ଚିତ୍ର 1B ଏବଂ ଚିତ୍ର S1A)। ମୋଟ, ଆମେ ମୋଟ 3013 ପ୍ରୋଟିନର ପରିମାଣ କରିଥିଲୁ, ଯାହା ମଧ୍ୟରୁ ପ୍ରାୟ 22% ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ପ୍ରୋଟିଓମ୍ ଉପରେ ଆଧାରିତ MitoCarta 2.0 ଆନୋଟେସନ୍ ଉପରେ ଆଧାରିତ ଥିଲା ଯେପରିକି ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ (ଚିତ୍ର 1E) (ଚିତ୍ର 1E) (24)। ସପ୍ତାହ 8 ରେ କରାଯାଇଥିବା ଡିଫରେନ୍ସିଆଲ୍ ଜିନ୍ ପ୍ରକାଶନ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦର୍ଶାଉଛି ଯେ ସମସ୍ତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ମଧ୍ୟରୁ କେବଳ 10.5% ରେ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପରିବର୍ତ୍ତନ ହୋଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 1F ଏବଂ ଚିତ୍ର S1F), ଯେଉଁଥିରୁ 195 ପ୍ରୋଟିନ୍ ନିମ୍ନ-ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ଏବଂ 120 ପ୍ରୋଟିନ୍ ଉପ-ନିୟନ୍ତ୍ରିତ (ଚିତ୍ର 1F) ଥିଲା। ଏହା ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଯେ ଏହି ଡାଟା ସେଟର "ଉଦ୍ଭାବନ ପଥ ବିଶ୍ଳେଷଣ" ଦର୍ଶାଉଛି ଯେ ଡିଫରେନ୍ସିଆଲ୍ ଭାବରେ ପ୍ରକାଶିତ ଜିନ୍ ମୁଖ୍ୟତଃ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ମେଟାବୋଲିକ୍ ପଥ (ଚିତ୍ର 1G) ର ଏକ ସୀମିତ ସେଟ୍ ସହିତ ଜଡିତ। ଆଶ୍ଚର୍ଯ୍ୟଜନକ ଭାବରେ, ଯଦିଓ OXPHOS ଏବଂ କ୍ୟାଲସିୟମ୍ ସିଗନାଲିଂ ସହିତ ଜଡିତ ପଥଗୁଡ଼ିକର ନିମ୍ନନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଫ୍ୟୁଜନ୍-ଅଭାବୀ PNs ରେ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଡିସଫଙ୍କସନ୍ ର ପ୍ରେରଣାକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରେ, ଅନ୍ୟ ବର୍ଗଗୁଡ଼ିକ ଯାହା ମୁଖ୍ୟତଃ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ ସହିତ ଜଡିତ, ତାହା ଯଥେଷ୍ଟ ଭାବରେ ବୃଦ୍ଧି ପାଏ, ଯାହା ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ PNs ରେ ଘଟୁଥିବା ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ ସହିତ ସମନ୍ୱୟ ରଖେ। ପୁନଃନିୟନ୍ତ୍ରଣ ସ୍ଥିର ଅକାର୍ଯ୍ୟ।
(A) CTRL ଏବଂ Mfn2cKO ମୂଷାର ସେରେବେଲାର ଅଂଶର ପ୍ରତିନିଧି କନଫୋକାଲ୍ ଫଟୋଗ୍ରାଫ୍ ଯାହା PN (କାଲବିଣ୍ଡିନ୍, ଧୂସର) ର କ୍ରମବର୍ଦ୍ଧିଷ୍ଣୁ କ୍ଷତି ଦର୍ଶାଉଛି; ନ୍ୟୁକ୍ଲିଅସ୍ DAPI ସହିତ ପ୍ରତିରୋଧିତ ହୋଇଥିଲା। (B) (A) ର ପରିମାଣ (ପରିବର୍ତ୍ତନର ଏକପାଖିଆ ବିଶ୍ଳେଷଣ, ***P<0.001; n = ତିନୋଟି ମୂଷାରୁ 4 ରୁ 6 ବୃତ୍ତ)। (C) ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ କାର୍ଯ୍ୟପ୍ରଣାଳୀ। (D) ପୁରକିଞ୍ଜେ (ଉପର) ଏବଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ କୋଷ ପ୍ରକାର (ମଧ୍ୟ) ପାଇଁ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ମାର୍କରଗୁଡ଼ିକର ଉତ୍ତାପ ମାନଚିତ୍ର ବଣ୍ଟନ। (E) ବର୍ଗୀକୃତ PN ରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସଂଖ୍ୟା ଦେଖାଉଥିବା ଭେନ୍ ଚିତ୍ର। (F) 8 ସପ୍ତାହରେ Mfn2cKO ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ଭିନ୍ନ ଭାବରେ ପ୍ରକାଶିତ ପ୍ରୋଟିନ୍‌ର ଜ୍ୱାଳାମୁଖୀ ପ୍ଲଟ୍ (1.3 ର ଗୁରୁତ୍ୱ କଟ-ଅଫ୍ ମୂଲ୍ୟ)। (G) ସୃଜନଶୀଳତା ପଥ ବିଶ୍ଳେଷଣ Mfn2cKO PN ରେ ପାଞ୍ଚଟି ସବୁଠାରୁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଉପ-ନିୟନ୍ତ୍ରଣ (ଲାଲ) ଏବଂ ନିମ୍ନ-ନିୟନ୍ତ୍ରଣ (ନୀଳ) ପଥକୁ 8 ସପ୍ତାହ ଭାବରେ ବର୍ଗୀକୃତ ଦର୍ଶାଉଛି। ପ୍ରତ୍ୟେକ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ପ୍ରୋଟିନର ହାରାହାରି ପ୍ରକାଶନ ସ୍ତର ଦେଖାଯାଇଛି। ଗ୍ରେସ୍କେଲ୍ ହିଟ୍ ମ୍ୟାପ୍: ଆଡଜଷ୍ଟ P ମୂଲ୍ୟ। ns, ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ନୁହେଁ।
ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ସ ତଥ୍ୟ ଦର୍ଶାଇଛି ଯେ ଜଟିଳ I, III, ଏବଂ IV ର ପ୍ରୋଟିନ ପ୍ରକାଶନ ଧୀରେ ଧୀରେ ହ୍ରାସ ପାଇଛି। ଜଟିଳ I, III, ଏବଂ IV ସମସ୍ତ ଅତ୍ୟାବଶ୍ୟକ mtDNA-ଏନକୋଡେଡ୍ ସବୟୁନିଟ୍ ଧାରଣ କରିଛି, ଯେତେବେଳେ ଜଟିଳ II, ଯାହା କେବଳ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟର-କୋଡେଡ୍ ଥିଲା, ମୂଳତଃ ପ୍ରଭାବିତ ହୋଇନାହିଁ (ଚିତ୍ର 2A ଏବଂ ଚିତ୍ର S2A)। । ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ସ ଫଳାଫଳ ସହିତ ସମନ୍ୱିତ, ସେରେବେଲାର ଟିସୁ ବିଭାଗଗୁଡ଼ିକର ଇମ୍ୟୁନୋହିଷ୍ଟୋକେମିଷ୍ଟ୍ରି ଦେଖାଇଛି ଯେ PN ରେ ଜଟିଳ IV ର MTCO1 (ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ସାଇଟୋକ୍ରୋମ୍ C ଅକ୍ସିଡେଜ୍ ସବୟୁନିଟ୍ 1) ସବୟୁନିଟ୍ ସ୍ତର ଧୀରେ ଧୀରେ ହ୍ରାସ ପାଇଛି (ଚିତ୍ର 2B)। mtDNA-ଏନକୋଡେଡ୍ ସବୟୁନିଟ୍ Mtatp8 ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ହ୍ରାସ ପାଇଛି (ଚିତ୍ର S2A), ଯେତେବେଳେ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟର-ଏନକୋଡେଡ୍ ATP ସିନ୍ଥେସ୍ ସବୟୁନିଟ୍ ର ସ୍ଥିର-ସ୍ଥିତି ସ୍ତର ଅପରିବର୍ତ୍ତିତ ରହିଛି, ଯାହା mtDNA ପ୍ରକାଶନ ସ୍ଥିର ଥିବା ସମୟରେ ଜଣାଶୁଣା ସ୍ଥିର ATP ସିନ୍ଥେସ୍ ସବଆସେମ୍ବଲି F1 ଜଟିଳ ସହିତ ସୁସଙ୍ଗତ। ଗଠନ ସ୍ଥିର ଅଛି। ବାଧା (7)। ରିଅଲ୍-ଟାଇମ୍ ପଲିମରେଜ୍ ଚେନ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା (qPCR) ଦ୍ୱାରା ସଜାଯାଇଥିବା Mfn2cKO PNs ରେ mtDNA ସ୍ତରର ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ mtDNA କପି ସଂଖ୍ୟାରେ ଧୀରେ ଧୀରେ ହ୍ରାସକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରିଥିଲା। ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଗୋଷ୍ଠୀ ସହିତ ତୁଳନା କଲେ, 8 ସପ୍ତାହ ବୟସରେ, mtDNA ସ୍ତରର ପ୍ରାୟ 20% ରଖା ଯାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 2C)। ଏହି ଫଳାଫଳ ସହିତ ସମନ୍ୱୟ ରଖି, Mfn2cKO PNs ର କନଫୋକାଲ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ଷ୍ଟେନିଂ DNA ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ସର ସମୟ-ନିର୍ଭରଶୀଳ ବ୍ୟବହାର ଦର୍ଶାଉଛି (ଚିତ୍ର 2D)। ଆମେ ଦେଖିଲୁ ଯେ କେବଳ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଅବନତି ଏବଂ ଚାପ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ଜଡିତ କିଛି ପ୍ରାର୍ଥୀଙ୍କୁ ଉପ-ନିୟନ୍ତ୍ରିତ କରାଯାଇଥିଲା, ଯେଉଁଥିରେ Lonp1, Afg3l2 ଏବଂ Clpx, ଏବଂ OXPHOS ଜଟିଳ ଆସେମ୍ବଲି କାରକ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ। ଆପୋପ୍ଟୋସିସ୍ ରେ ଜଡିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସ୍ତରରେ କୌଣସି ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପରିବର୍ତ୍ତନ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇନଥିଲା (ଚିତ୍ର S2B)। ସେହିପରି, ଆମେ ଦେଖିଲୁ ଯେ କ୍ୟାଲସିୟମ୍ ପରିବହନରେ ଜଡିତ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆ ଏବଂ ଏଣ୍ଡୋପ୍ଲାଜମିକ୍ ରେଟିକୁଲମ୍ ଚ୍ୟାନେଲଗୁଡ଼ିକରେ କେବଳ ସାମାନ୍ୟ ପରିବର୍ତ୍ତନ ହୋଇଛି (ଚିତ୍ର S2C)। ଏହା ବ୍ୟତୀତ, ଅଟୋଫାଜି-ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ପ୍ରୋଟିନର ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନରେ କୌଣସି ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପରିବର୍ତ୍ତନ ମିଳିଲା ନାହିଁ, ଯାହା ଇମ୍ୟୁନୋହିଷ୍ଟୋକେମିଷ୍ଟ୍ରି ଏବଂ ଇଲେକ୍ଟ୍ରନ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି (ଚିତ୍ର S3) ଦ୍ୱାରା ଭିଭୋରେ ପରିଲକ୍ଷିତ ଅଟୋଫାଗୋସୋମର ଦୃଶ୍ୟମାନ ପ୍ରେରଣା ସହିତ ସୁସଙ୍ଗତ। ତଥାପି, PNs ରେ ପ୍ରଗତିଶୀଳ OXPHOS ଡିସଫଙ୍କସନ୍ ସ୍ପଷ୍ଟ ଅଲ୍ଟ୍ରାଷ୍ଟ୍ରକ୍ଚରାଲ୍ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ପରିବର୍ତ୍ତନ ସହିତ ହୋଇଥାଏ। 5 ଏବଂ 8 ସପ୍ତାହ ବୟସର Mfn2cKO PNs ର କୋଷ ଶରୀର ଏବଂ ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ଗଛରେ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ କ୍ଲଷ୍ଟର ଦେଖାଯାଇପାରେ, ଏବଂ ଭିତର ଝିଲ୍ଲୀ ଗଠନରେ ଗଭୀର ପରିବର୍ତ୍ତନ ଆସିଛି (ଚିତ୍ର S4, A ଏବଂ B)। ଏହି ଅଲ୍ଟ୍ରାଷ୍ଟ୍ରକ୍ଚରାଲ୍ ପରିବର୍ତ୍ତନ ଏବଂ mtDNA ରେ ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ହ୍ରାସ ସହିତ, ଟେଟ୍ରାମେଥିଲରୋଡାମାଇନ୍ ମିଥାଇଲ୍ ଏଷ୍ଟର (TMRM) ସହିତ ତୀବ୍ର ସେରେବ୍ରାଲ୍ ସେରେବେଲାର୍ ସ୍ଲାଇସ୍‌ର ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦେଖାଇଲା ଯେ Mfn2cKO PNs ରେ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ମାଇଟ୍କ୍ଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ପୋଟେନ୍ସିଆଲ୍ ଯଥେଷ୍ଟ ହ୍ରାସ ପାଇଛି (ଚିତ୍ର S4C)।
(କ) OXPHOS ଜଟିଳର ପ୍ରକାଶନ ସ୍ତରର ସମୟ ପାଠ୍ୟକ୍ରମ ବିଶ୍ଳେଷଣ। 8 ସପ୍ତାହରେ କେବଳ P<0.05 ସହିତ ପ୍ରୋଟିନଗୁଡ଼ିକୁ ବିଚାର କରନ୍ତୁ (ଦୁଇ-ପାଖ ANOVA)। ବିନ୍ଦୁଯୁକ୍ତ ରେଖା: CTRL ତୁଳନାରେ କୌଣସି ସମାୟୋଜନ ନାହିଁ। (ଖ) ବାମ: ଆଣ୍ଟି-MTCO1 ଆଣ୍ଟିବଡି (ସ୍କେଲ ବାର୍, 20 μm) ସହିତ ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା ଏକ ସେରେବେଲାର୍ ସେକ୍ସନର ଏକ ଉଦାହରଣ। ପୁରକିଞ୍ଜେ କୋଷ ଶରୀର ଦ୍ୱାରା ଅଧିକୃତ ଅଞ୍ଚଳ ହଳଦିଆ ଦ୍ୱାରା ଆଚ୍ଛାଦିତ। ଡାହାଣ: MTCO1 ସ୍ତରର ପରିମାଣ (ପରିବର୍ତ୍ତନର ଏକପାଖ ବିଶ୍ଳେଷଣ; n = ତିନୋଟି ମୂଷାରୁ 7 ରୁ 20 କୋଷ ବିଶ୍ଳେଷଣ)। (ଗ) ସଜାଯାଇଥିବା PN ରେ mtDNA କପି ସଂଖ୍ୟାର qPCR ବିଶ୍ଳେଷଣ (ପରିବର୍ତ୍ତନର ଏକପାଖ ବିଶ୍ଳେଷଣ; n = 3 ରୁ 7 ମୂଷା)। (ଘ) ବାମ: ଏକ ଆଣ୍ଟି-DNA ଆଣ୍ଟିବଡି (ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 20 μm) ସହିତ ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା ଏକ ସେରେବେଲାର୍ ସ୍ଲାଇସର ଏକ ଉଦାହରଣ। ପୁରକିଞ୍ଜେ କୋଷ ଶରୀର ଦ୍ୱାରା ଅଧିକୃତ ଅଞ୍ଚଳ ହଳଦିଆ ଦ୍ୱାରା ଆଚ୍ଛାଦିତ। ଡାହାଣ: mtDNA କ୍ଷତଗୁଡ଼ିକର ପରିମାଣ (ପରିବର୍ତ୍ତନର ଏକପାଖ ବିଶ୍ଳେଷଣ; n = ତିନୋଟି ମୂଷାରୁ 5 ରୁ 9 କୋଷ)। (E) ଏକ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ-କୋଷ ପ୍ୟାଚ୍ କ୍ଲାମ୍ପ ରେକର୍ଡିଂରେ mitoYFP + ପୁରକିଞ୍ଜେ କୋଷ (ତୀର) ଦେଖାଉଥିବା ଏକ ତୀବ୍ର ସେରେବେଲାର ଅଂଶର ଏକ ଉଦାହରଣ। (F) IV କର୍ଭର ପରିମାଣୀକରଣ। (G) CTRL ଏବଂ Mfn2cKO ପୁରକିଞ୍ଜେ କୋଷରେ ଡିପୋଲାରାଇଜିଙ୍ଗ୍ କରେଣ୍ଟ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନର ପ୍ରତିନିଧି ରେକର୍ଡିଂ। ଉପର ଟ୍ରେସ୍: AP ଟ୍ରିଗର କରିଥିବା ପ୍ରଥମ ପଲ୍ସ। ତଳ ଟ୍ରେସ୍: ସର୍ବାଧିକ AP ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି। (H) ପୋଷ୍ଟସିନାପ୍ଟିକ୍ ସ୍ୱତଃସ୍ପୃତ ଇନପୁଟ୍ (sPSPs) ର ପରିମାଣୀକରଣ। ପ୍ରତିନିଧି ରେକର୍ଡିଂ ଟ୍ରେସ୍ ଏବଂ ଏହାର ଜୁମ୍ ଅନୁପାତ (I) ରେ ଦର୍ଶାଯାଇଛି। ତିନୋଟି ମୂଷାରୁ n = 5 ରୁ 20 କୋଷ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଛି। ତଥ୍ୟକୁ ମଧ୍ୟମ ± SEM ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରାଯାଇଛି; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001। (J) ପର୍ଫୋରେଟେଡ୍ ପ୍ୟାଚ୍ କ୍ଲାମ୍ପ ମୋଡ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ରେକର୍ଡ କରାଯାଇଥିବା ସ୍ୱତଃସ୍ପୃତ AP ର ପ୍ରତିନିଧି ଟ୍ରେସ୍। ଉପର ଟ୍ରେସ୍: ସର୍ବାଧିକ AP ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି। ତଳ ଟ୍ରେସ୍: ଏକକ AP ର ଜୁମ୍। (K) (J) ଅନୁସାରେ ହାରାହାରି ଏବଂ ସର୍ବାଧିକ AP ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ପରିମାଣୀକରଣ କରନ୍ତୁ। ମାନ-ହ୍ୱିଟନି ପରୀକ୍ଷା; n = 5 କୋଷ ଚାରୋଟି ମୂଷାରୁ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ତଥ୍ୟକୁ ମଧ୍ୟମ±SEM ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରାଯାଇଛି; ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ନୁହେଁ।
8 ସପ୍ତାହ ବୟସର Mfn2cKO PN ରେ ସ୍ପଷ୍ଟ OXPHOS କ୍ଷତି ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିଲା, ଯାହା ସୂଚାଇଥିଲା ଯେ ନ୍ୟୁରନ୍‌ର ଶାରୀରିକ କାର୍ଯ୍ୟ ଗୁରୁତର ଭାବରେ ଅସ୍ୱାଭାବିକ। ତେଣୁ, ଆମେ 4 ରୁ 5 ସପ୍ତାହ ଏବଂ 7 ରୁ 8 ସପ୍ତାହରେ ତୀବ୍ର ସେରେବେଲାର ସ୍ଲାଇସରେ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ-କୋଷ ପ୍ୟାଚ୍ କ୍ଲାମ୍ପ ରେକର୍ଡିଂ କରି OXPHOS-ଅଭାବୀ ନ୍ୟୁରନ୍‌ର ନିଷ୍କ୍ରିୟ ବୈଦ୍ୟୁତିକ ବୈଦ୍ୟୁତିକ ବୈଦ୍ୟୁତିକ ଗୁଣଗୁଡ଼ିକୁ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିଥିଲୁ (ଚିତ୍ର 2E)। ଅପ୍ରତ୍ୟାଶିତ ଭାବରେ, Mfn2cKO ନ୍ୟୁରନ୍‌ର ହାରାହାରି ବିଶ୍ରାମ ଝିଲ୍ଲୀ ସମ୍ଭାବନା ଏବଂ ଇନପୁଟ୍ ପ୍ରତିରୋଧ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ସହିତ ସମାନ ଥିଲା, ଯଦିଓ କୋଷ ମଧ୍ୟରେ ସୂକ୍ଷ୍ମ ପାର୍ଥକ୍ୟ ଥିଲା (ସାରଣୀ 1)। ସେହିପରି, 4 ରୁ 5 ସପ୍ତାହ ବୟସରେ, କରେଣ୍ଟ-ଭୋଲଟେଜ୍ ସମ୍ପର୍କରେ (IV ବକ୍ର) କୌଣସି ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପରିବର୍ତ୍ତନ ମିଳିଲା ନାହିଁ (ଚିତ୍ର 2F)। ତଥାପି, 7 ରୁ 8 ସପ୍ତାହ ବୟସର କୌଣସି Mfn2cKO ନ୍ୟୁରନ୍ IV ରେଜିମେନ୍ (ହାଇପରପୋଲାରାଇଜେସନ୍ ଷ୍ଟେପ୍) ରୁ ବଞ୍ଚି ପାରି ନଥିଲେ, ଯାହା ସୂଚାଇଥିଲା ଯେ ଏହି ଶେଷ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ହାଇପରପୋଲାରାଇଜେସନ୍ ସମ୍ଭାବନା ପ୍ରତି ସ୍ପଷ୍ଟ ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ଅଛି। ବିପରୀତରେ, Mfn2cKO ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ, ପୁନରାବୃତ୍ତିକାରୀ କାର୍ଯ୍ୟ ସମ୍ଭାବନା (AP) ନିର୍ଗମନ ସୃଷ୍ଟି କରୁଥିବା ଡିପୋଲାରାଇଜିଂ କରେଣ୍ଟ୍ ଭଲ ଭାବରେ ସହ୍ୟ କରାଯାଏ, ଯାହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ ସେମାନଙ୍କର ସାମଗ୍ରିକ ନିର୍ଗମନ ଢାଞ୍ଚା 8-ସପ୍ତାହ ପୁରୁଣା ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ନ୍ୟୁରନ୍‌ଠାରୁ ଯଥେଷ୍ଟ ଭିନ୍ନ ନୁହେଁ (ସାରଣୀ 1 ଏବଂ ଚିତ୍ର 2G)। ସେହିପରି, ସ୍ୱତଃସ୍ଫୂର୍ତ୍ତ ପୋଷ୍ଟସିନାପ୍ଟିକ୍ କରେଣ୍ଟ୍ (sPSCs) ର ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ଏବଂ ଆମ୍ପ୍ଲିଚ୍ୟୁଡ୍ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଗୋଷ୍ଠୀର ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ସହିତ ତୁଳନୀୟ ଥିଲା, ଏବଂ ଘଟଣାଗୁଡ଼ିକର ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ସମାନ ବୃଦ୍ଧି ସହିତ 4 ସପ୍ତାହରୁ 5 ସପ୍ତାହରୁ 7 ସପ୍ତାହରୁ 8 ସପ୍ତାହ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 2, H ଏବଂ I)। PNs ରେ ସିନାପ୍ଟିକ୍ ପରିପକ୍ୱତାର ଅବଧି (25)। ଛିଦ୍ରିତ PNs ପ୍ୟାଚ୍ ପରେ ସମାନ ଫଳାଫଳ ପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇଥିଲା। ଏହି ବିନ୍ୟାସ ସେଲୁଲାର୍ ATP ତ୍ରୁଟିର ସମ୍ଭାବ୍ୟ କ୍ଷତିପୂରଣକୁ ରୋକିଥାଏ, ଯେପରି ସମଗ୍ର-କୋଷ ପ୍ୟାଚ୍ କ୍ଲାମ୍ପ ରେକର୍ଡିଂରେ ହୋଇପାରେ। ବିଶେଷକରି, Mfn2cKO ନ୍ୟୁରନ୍‌ର ବିଶ୍ରାମ ଝିଲ୍ଲୀ ସମ୍ଭାବନା ଏବଂ ସ୍ୱତଃସ୍ଫୂର୍ତ୍ତ ଫାୟାରିଂ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ପ୍ରଭାବିତ ହୋଇନଥିଲା (ଚିତ୍ର 2, J ଏବଂ K)। ସଂକ୍ଷେପରେ, ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକ ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ ସ୍ପଷ୍ଟ OXPHOS ଅକ୍ଷମତା ଥିବା PNଗୁଡ଼ିକ ଉଚ୍ଚ-ଆବୃତ୍ତି ନିର୍ଗମନ ପଦ୍ଧତି ସହିତ ଭଲ ଭାବରେ ମୁକାବିଲା କରିପାରିବେ, ଏହା ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ ଏକ କ୍ଷତିପୂରଣ ଯନ୍ତ୍ର ଅଛି ଯାହା ସେମାନଙ୍କୁ ପ୍ରାୟ ସ୍ୱାଭାବିକ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫିଜିଓଲୋଜିକାଲ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ବଜାୟ ରଖିବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ।
ତଥ୍ୟକୁ ମଧ୍ୟମ ± SEM ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରାଯାଇଛି (ପରିବର୍ତ୍ତନର ଏକପାଖିଆ ବିଶ୍ଳେଷଣ, ହୋମ-ସିଡାକର ବହୁବିକ ତୁଳନା ପରୀକ୍ଷା; *P<0.05)। ୟୁନିଟ୍ ସଂଖ୍ୟାକୁ ବନ୍ଧନୀ ଦ୍ୱାରା ସୂଚିତ କରାଯାଇଛି।
ଆମେ ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ସ ଡାଟାସେଟ୍ (ଚିତ୍ର 1G) ରେ ଥିବା କୌଣସି ବର୍ଗରେ ଏପରି ପଥ ଅଛି କି ନାହିଁ ତାହା ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିବାକୁ ବାହାରିଥିଲୁ ଯାହା ଗୁରୁତର OXPHOS ଅଭାବକୁ ପ୍ରତିହତ କରିପାରିବ, ଏହା ଦ୍ଵାରା ପ୍ରଭାବିତ PN କାହିଁକି ପ୍ରାୟ ସ୍ୱାଭାବିକ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫିଜିଓଲୋଜି ବଜାୟ ରଖିପାରିବ ତାହା ବ୍ୟାଖ୍ୟା କରିଥିଲୁ (ଚିତ୍ର 2, E ରୁ K)। ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ସ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦେଖାଇଥିଲା ଯେ ବ୍ରାଞ୍ଚେଡ୍ ଚେନ୍ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ (BCAA) ର କ୍ୟାଟାବୋଲିଜିମ୍ ସହିତ ଜଡିତ ଏନଜାଇମ୍ଗୁଡ଼ିକ ଯଥେଷ୍ଟ ଭାବରେ ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ହୋଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 3A ଏବଂ ଚିତ୍ର S5A), ଏବଂ ଚୂଡ଼ାନ୍ତ ଉତ୍ପାଦ ଏସିଟେଲ୍-CoA (CoA) କିମ୍ବା ସକ୍ସିନାଇଲ୍ CoA ଆର୍ଟେରୟୋସ୍କ୍ଲେରୋସିସ୍ ଏସିଡ୍ (TCA) ଚକ୍ରରେ ଟ୍ରାଇକାର୍ବୋକ୍ସିଲେଟ୍ସକୁ ପରିପୂରକ କରିପାରିବ। ଆମେ ଦେଖିଲୁ ଯେ BCAA ଟ୍ରାନ୍ସାମାଇନେଜ୍ 1 (BCAT1) ଏବଂ BCAT2 ର ବିଷୟବସ୍ତୁ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଛି। ସେମାନେ α-ketoglutarate (26) ରୁ ଗ୍ଲୁଟାମେଟ୍ ସୃଷ୍ଟି କରି BCAA କ୍ୟାଟାବୋଲିଜିମ୍ ର ପ୍ରଥମ ପଦକ୍ଷେପକୁ ଉତ୍ତେଜିତ କରନ୍ତି। ବ୍ରାଞ୍ଚେଡ୍ ଚେନ୍ କେଟୋ ଏସିଡ୍ ଡିହାଇଡ୍ରୋଜେନେଜ୍ (BCKD) ଜଟିଳ ଗଠନ କରୁଥିବା ସମସ୍ତ ଉପୟୁନିଟ୍ ଉପନିୟନ୍ତ୍ରିତ (ଜଟିଳ ପରିଣାମସ୍ୱରୂପ BCAA କାର୍ବନ କଙ୍କାଳର ପରବର୍ତ୍ତୀ ଏବଂ ଅପରିବର୍ତ୍ତନୀୟ ଡିକାର୍ବୋକ୍ସିଲେସନ୍କୁ ଉତ୍ତେଜିତ କରେ) (ଚିତ୍ର 3A ଏବଂ ଚିତ୍ର S5A)। ତଥାପି, ସଜାଯାଇଥିବା PN ରେ BCAA ରେ କୌଣସି ସ୍ପଷ୍ଟ ପରିବର୍ତ୍ତନ ମିଳିଲା ନାହିଁ, ଯାହା ଏହି ଅତ୍ୟାବଶ୍ୟକ ଆମିନୋ ଏସିଡର ବର୍ଦ୍ଧିତ କୋଷୀୟ ଗ୍ରହଣ କିମ୍ବା TCA ଚକ୍ର (ଚିତ୍ର S5B) କୁ ପରିପୂରକ କରିବା ପାଇଁ ଅନ୍ୟ ଉତ୍ସ (ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ କିମ୍ବା ଲାକ୍ଟିକ୍ ଏସିଡ୍) ବ୍ୟବହାର ହେତୁ ହୋଇପାରେ। OXPHOS ଅଭାବୀ PN ଗୁଡ଼ିକ ମଧ୍ୟ 8 ସପ୍ତାହ ବୟସରେ ବର୍ଦ୍ଧିତ ଗ୍ଲୁଟାମାଇନ୍ ବିଘଟନ ଏବଂ ଟ୍ରାନ୍ସାମିନେଶନ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଦେଖାଇଥିଲେ, ଯାହା ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଏନଜାଇମ୍ ଗ୍ଲୁଟାମିନେଜ୍ (GLS) ଏବଂ ଗ୍ଲୁଟାମିନ୍ ପାଇରୁଭେଟ୍ ଟ୍ରାନ୍ସାମିନେଶ୍ 2 (GPT2) (ଚିତ୍ର 3, A ଏବଂ C) ର ଉପନିୟନ୍ତ୍ରିତ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରତିଫଳିତ ହୋଇପାରେ। ଏହା ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଯେ GLS ର ଉପ-ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ସ୍ପ୍ଲାଇସ୍ଡ୍ ଆଇସୋଫର୍ମ ଗ୍ଲୁଟାମିନେଜ୍ C (GLS-GAC) ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ସୀମିତ (Mfn2cKO/CTRL ର ପରିବର୍ତ୍ତନ ପ୍ରାୟ 4.5-ଗୁଣ, P = 0.05), ଏବଂ କର୍କଟ ଟିସୁରେ ଏହାର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଉପ-ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ମାଇଟୋକୋଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଜୈବଶକ୍ତିକୁ ସମର୍ଥନ କରିପାରିବ। (27)।
(A) 8 ସପ୍ତାହରେ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ମାର୍ଗ ପାଇଁ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସ୍ତରରେ ଫୋଲ୍ଡ ପରିବର୍ତ୍ତନ ଦେଖାଏ। (B) ଆଣ୍ଟି-PCx ଆଣ୍ଟିବଡି (ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 20 μm) ସହିତ ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା ଏକ ସେରିବେଲାର୍ ସ୍ଲାଇସ୍‌ର ଉଦାହରଣ। ହଳଦିଆ ତୀର ପୁରକିଞ୍ଜେ କୋଷ ଶରୀରକୁ ସୂଚିତ କରେ। (C) ଏଥେରାସ୍କ୍ଲୋରୋସିସ୍ ପାଇଁ ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପ୍ରାର୍ଥୀ ଭାବରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ସମୟ ପାଠ୍ୟକ୍ରମ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରକାଶନ ବିଶ୍ଳେଷଣ (ବହୁ ଟି-ପରୀକ୍ଷଣ, *FDR <5%; n = 3-5 ମୂଷା)। (D) ଉପରେ: [1-13C] ପାଇରୁଭେଟ୍ ଟ୍ରେସରରେ ଥିବା ଲେବଲ୍ କାର୍ବନରେ ପ୍ରବେଶ କରିବାର ବିଭିନ୍ନ ଉପାୟ (ଯଥା, PDH କିମ୍ବା ଟ୍ରାନ୍ସ-ଧମନୀ ମାର୍ଗ ମାଧ୍ୟମରେ) ଦର୍ଶାଯାଇଥିବା ଏକ ସ୍କିମେଟିକ୍ ଚିତ୍ର। ତଳ: [1-13C] ପାଇରୁଭେଟ୍ (ଯୋଡ଼ା ହୋଇଥିବା ଟି-ପରୀକ୍ଷଣ; ** P <0.01) ସହିତ ତୀବ୍ର ସେରିବେଲାର୍ ସ୍ଲାଇସ୍‌କୁ ଲେବଲ୍ କରିବା ପରେ ଏକକ-ଲେବଲ୍ କାର୍ବନ (M1) ଆସ୍ପାର୍ଟିକ୍ ଏସିଡ୍, ସାଇଟ୍ରିକ୍ ଏସିଡ୍ ଏବଂ ମାଲିକ୍ ଏସିଡ୍‌ରେ ରୂପାନ୍ତରିତ ହେବାର ଶତକଡ଼ା ଦେଖାଏ। (E) ସୂଚିତ ପଥଟିର ବ୍ୟାପକ ସମୟ ଇତିହାସ ବିଶ୍ଳେଷଣ। 8 ସପ୍ତାହରେ କେବଳ P<0.05 ଥିବା ପ୍ରୋଟିନଗୁଡ଼ିକୁ ବିଚାର କରନ୍ତୁ। ଡ୍ୟାସ୍ଡ ରେଖା: କୌଣସି ସମାୟୋଜନ ମୂଲ୍ୟ ନାହିଁ (ପରିବର୍ତ୍ତନର ଦ୍ୱି-ପାଖ ବିଶ୍ଳେଷଣ; * P <0.05; *** P <0.001)। ତଥ୍ୟକୁ ମଧ୍ୟମ±SEM ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରାଯାଏ।
ଆମର ବିଶ୍ଳେଷଣରେ, BCAA କ୍ୟାଟାବୋଲିଜିମ୍ ପ୍ରମୁଖ ଉପ-ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ପଥ ମଧ୍ୟରୁ ଗୋଟିଏ ହୋଇଗଲାଣି। ଏହି ତଥ୍ୟ ଦୃଢ଼ ଭାବରେ ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ TCA ଚକ୍ରରେ ପ୍ରବେଶ କରୁଥିବା ଭେଣ୍ଟିଲେସନ୍ ପରିମାଣ OXPHOS ଅଭାବୀ PN ରେ ପରିବର୍ତ୍ତନ ହୋଇପାରେ। ଏହା ନ୍ୟୁରୋନାଲ୍ ମେଟାବୋଲିକ୍ ରିୱାୟାରିଂର ଏକ ପ୍ରମୁଖ ରୂପକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରିପାରେ, ଯାହା ଗୁରୁତର OXPHOS ଡିସଫଙ୍କସନ୍ ରକ୍ଷଣାବେକ୍ଷଣ ସମୟରେ ନ୍ୟୁରୋନାଲ୍ ଫିଜିଓଲୋଜି ଏବଂ ବଞ୍ଚିବା ଉପରେ ସିଧାସଳଖ ପ୍ରଭାବ ପକାଇପାରେ। ଏହି ପରିକଳ୍ପନା ସହିତ ସମନ୍ୱିତ, ଆମେ ପାଇଲୁ ଯେ ମୁଖ୍ୟ ଆଣ୍ଟି-ଏଥରୋସ୍କ୍ଲେରୋଟିକ୍ ଏନଜାଇମ୍ PCx ଉପ-ନିୟନ୍ତ୍ରିତ (Mfn2cKO/CTRL ପ୍ରାୟ 1.5 ଥର ପରିବର୍ତ୍ତନ ହୁଏ; ଚିତ୍ର 3A), ଯାହା ପାଇରୁଭେଟ୍‌କୁ ଅକ୍ସାଲୋଏସେଟେଟ୍ (28) ରେ ପରିବର୍ତ୍ତନକୁ ଉତ୍ତେଜିତ କରେ, ଯାହା ମସ୍ତିଷ୍କ ଟିସୁରେ ଥିବା ବିଶ୍ୱାସ କରାଯାଏ। ରେ ପ୍ରକାଶନ ଆଷ୍ଟ୍ରୋସାଇଟ୍ସ (29, 30) ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ସୀମିତ। ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ସ ଫଳାଫଳ ସହିତ ସମନ୍ୱିତ, କନଫୋକାଲ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ଦେଖାଇଲା ଯେ OXPHOS-ଅଭାବୀ PNs ରେ PCx ପ୍ରକାଶନ ବିଶେଷ ଭାବରେ ଏବଂ ଯଥେଷ୍ଟ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଥିଲା, ଯେତେବେଳେ PCx ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ମୁଖ୍ୟତଃ ନିୟନ୍ତ୍ରଣର ନିକଟବର୍ତ୍ତୀ ବର୍ଗମ୍ୟାନ୍ ଗ୍ଲିଆଲ୍ କୋଷଗୁଡ଼ିକ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ସୀମିତ ଥିଲା (ଚିତ୍ର 3B)। PCx ର ପରିଲକ୍ଷିତ ଉପନିୟନ୍ତ୍ରଣକୁ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଭାବରେ ପରୀକ୍ଷା କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ [1-13C] ପାଇରୁଭେଟ୍ ଟ୍ରେସର୍ ସହିତ ତୀବ୍ର ସେରେବେଲାର୍ ସ୍ଲାଇସ୍‌ର ଚିକିତ୍ସା କରିଥିଲୁ। ଯେତେବେଳେ ପାଇରୁଭେଟ୍‌କୁ ପାଇରୁଭେଟ୍‌ ଡିହାଇଡ୍ରୋଜେନେଜ୍ (PDH) ଦ୍ୱାରା ଅକ୍ସିଡାଇଜ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଏହାର ଆଇସୋଟୋପ୍ ଲେବଲ୍ ଅଦୃଶ୍ୟ ହୋଇଯାଇଥିଲା, କିନ୍ତୁ ଯେତେବେଳେ ପାଇରୁଭେଟ୍‌କୁ ଭାସ୍କୁଲାର୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଦ୍ୱାରା ମେଟାବୋଲିଜାଇଜ୍ କରାଯାଏ (ଚିତ୍ର 3D) ସେତେବେଳେ ଏହାକୁ TCA ଚକ୍ର ମଧ୍ୟବର୍ତ୍ତୀରେ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା। ଆମର ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ସ ତଥ୍ୟର ସମର୍ଥନରେ, ଆମେ Mfn2cKO ସ୍ଲାଇସ୍‌ର ଆସ୍ପାର୍ଟିକ୍ ଏସିଡ୍‌ରେ ଏହି ଟ୍ରେସର୍‌ରୁ ବହୁ ସଂଖ୍ୟକ ମାର୍କର ଦେଖିଥିଲୁ, ଯେତେବେଳେ ସାଇଟ୍ରିକ୍ ଏସିଡ୍ ଏବଂ ମାଲିକ୍ ଏସିଡ୍‌ର ମଧ୍ୟମ ଧାରା ଥିଲା, ଯଦିଓ ଏହା ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ନୁହେଁ (ଚିତ୍ର 3D)।
ଡୋପାର୍ମିକ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ ଫ୍ୟାକ୍ଟର A ଜିନ୍ (Tfam) (ଚିତ୍ର S6B) କୁ ଧ୍ୱଂସ କରୁଥିବା ଡୋପାର୍ମିକ ନଳୀ ଦ୍ୱାରା ହେଉଥିବା ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ ଡିସଫଙ୍କସନ୍ ସହିତ MitoPark ମୂଷାର ଡୋପାର୍ମିକ ନଳୀରେ, PCx ପ୍ରକାଶନ ମଧ୍ୟ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଥିଲା (31), ଯାହା ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ଆସିଟୋନ୍ ଏସିଡ୍ ଆର୍ଟେରିଓସ୍କ୍ଲେରୋସିସ୍ ଶରୀରରେ ନ୍ୟୁରୋନାଲ OXPHOS ର ଡିସଫଙ୍କସନ୍ ସମୟରେ ରୋଗର ଘଟନା ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ହୁଏ। ଏହା ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଯେ ଏହା ଦେଖାଯାଇଛି ଯେ ଅନନ୍ୟ ଏନଜାଇମ୍ (32-34) ଯାହା ଆର୍ଟେରିଓସ୍କ୍ଲେରୋସିସ୍ ସହିତ ଜଡିତ ନ୍ୟୁରନରେ ପ୍ରକାଶିତ ହୋଇପାରେ ତାହା OXPHOS ରେ ଅଭାବ ଥିବା PNs, ଯେପରିକି propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA କୁ succinyl-CoA ଏବଂ mitochondrial malic ଏନଜାଇମ୍ 3 (ME3) ରେ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରେ, ଯାହାର ମୁଖ୍ୟ ଭୂମିକା ହେଉଛି ମାଲେଟ୍ ରୁ ପାଇରୁଭେଟ୍ ପୁନରୁଦ୍ଧାର କରିବା (ଚିତ୍ର 3, A ଏବଂ C) (33, 35)। ଏହା ସହିତ, ଆମେ Pdk3 ଏନଜାଇମରେ ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଲୁ, ଯାହା ଫସଫୋରିଲେଟ୍ କରେ ଏବଂ PDH (36) କୁ ନିଷ୍କ୍ରିୟ କରେ, ଯେତେବେଳେ PDH କିମ୍ବା PDH ଏନଜାଇମ ଜଟିଳକୁ ସକ୍ରିୟ କରୁଥିବା Pdp1 ଏନଜାଇମରେ କୌଣସି ପରିବର୍ତ୍ତନ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇନଥିଲା (ଚିତ୍ର 3A)। ସ୍ଥିର ଭାବରେ, Mern2cKO PNs ରେ, Ser293 (PDH ର ଏନଜାଇମ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ବାଧା ଦେବା ପାଇଁ ଜଣାଶୁଣା) ରେ PDH ଜଟିଳର ପାଇରୁଭେଟ୍ ଡିହାଇଡ୍ରୋଜେନେଜ୍ E1 ଉପାଦାନର α1 ସବୟୁନିଟ୍ α (PDHE1α) ସବୟୁନିଟ୍ ର ଫସଫୋରାଇଲେସନ୍ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର S6C) (ଚିତ୍ର S6C)। ପାଇରୁଭେଟର କୌଣସି ଭାସ୍କୁଲାର୍ ପ୍ରବେଶ ନାହିଁ।
ଶେଷରେ, ଆମେ ପାଇଲୁ ଯେ ସେରିନ୍ ଏବଂ ଗ୍ଲାଇସିନ୍ ଜୈବସଂଶ୍ଳେଷଣର ସୁପର ପଥ, ସମ୍ପର୍କିତ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଫୋଲେଟ୍ (1C) ଚକ୍ର ଏବଂ ପ୍ରୋଲାଇନ୍ ଜୈବସଂଶ୍ଳେଷଣ (ଚିତ୍ର 1G ଏବଂ ଚିତ୍ର S5C) ସମସ୍ତ ରିପୋର୍ଟ ଅନୁଯାୟୀ, ସକ୍ରିୟକରଣ ପ୍ରକ୍ରିୟା ସମୟରେ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ଉନ୍ନତ-ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ହୋଇଥାଏ। ଆଖପାଖର ଟିସୁଗୁଡ଼ିକ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଡିସଫଂକ୍ସନ୍ (5-7) ସହିତ ସକ୍ରିୟ ହୋଇଥାଏ। ଏହି ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ସ ତଥ୍ୟକୁ ସମର୍ଥନ କରୁଥିବା କନଫୋକାଲ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦେଖାଇଛି ଯେ OXPHOS ଅନୁପସ୍ଥିତ PN ରେ, 8 ସପ୍ତାହ ବୟସର ମୂଷାର ସେରିବେଲାର୍ ସ୍ଲାଇସ୍ ସେରିନ୍ ହାଇଡ୍ରୋକ୍ସିମିଥାଇଲ୍ ଟ୍ରାନ୍ସଫରେଜ୍ 2 (SHMT2) ର ଶିକାର ହୋଇଥିଲେ, ଯାହା ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଫୋଲେଟ୍ ଚକ୍ରର ଏକ ପ୍ରମୁଖ ଏନଜାଇମ୍। ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପ୍ରତିରକ୍ଷା ପ୍ରତିକ୍ରିୟା (ଚିତ୍ର S5D)। 13 CU-ଗ୍ଲୁକୋଜ୍-ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟେଡ୍ ଆକ୍ୟୁଟ୍ ସେରିବେଲାର୍ ସ୍ଲାଇସ୍ ରେ, ମେଟାବୋଲିକ୍ ଟ୍ରେସିଂ ପରୀକ୍ଷଣ ସେରିନ୍ ଏବଂ ପ୍ରୋଲାଇନ୍ ଜୈବସଂଶ୍ଳେଷଣର ଉନ୍ନତ-ନିୟନ୍ତ୍ରଣକୁ ଆହୁରି ନିଶ୍ଚିତ କରିଥିଲା, ଯାହା ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ସେରିନ୍ ଏବଂ ପ୍ରୋଲାଇନ୍ ରେ କାର୍ବନ ଆଇସୋଫର୍ମର ପ୍ରବାହ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଛି (ଚିତ୍ର S5E)। ଯେହେତୁ GLS ଏବଂ GPT2 ଦ୍ୱାରା ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଗୁଡ଼ିକ ଗ୍ଲୁଟାମାଇନ୍ ରୁ ଗ୍ଲୁଟାମେଟ୍ ର ସଂଶ୍ଳେଷଣ ଏବଂ ଗ୍ଲୁଟାମେଟ୍ ଏବଂ α-କେଟୋଗ୍ଲୁଟାରେଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ଟ୍ରାନ୍ସାମିନେଶନ୍ ପାଇଁ ଦାୟୀ, ସେମାନଙ୍କର ଉପନିୟନ୍ତ୍ରଣ ସୂଚିତ କରେ ଯେ OXPHOS-ଅଭାବୀ ନ୍ୟୁରନ୍‌ମାନଙ୍କର ଗ୍ଲୁଟାମେଟ୍ ପାଇଁ ଚାହିଦା ବୃଦ୍ଧି ପାଇଛି, ଏହା ପ୍ରୋଲାଇନ୍‌ର ବର୍ଦ୍ଧିତ ଜୈବ ସଂଶ୍ଳେଷଣକୁ ବଜାୟ ରଖିବା ପାଇଁ ଲକ୍ଷ୍ୟ କରାଯାଇପାରେ (ଚିତ୍ର S5C)। ଏହି ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡ଼ିକର ବିପରୀତରେ, PN-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ Mfn2cKO ମୂଷାରୁ ସେରେବେଲାର୍ ଆଷ୍ଟ୍ରୋସାଇଟ୍ସର ଏକ ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦେଖାଇଲା ଯେ ଏହି ପଥଗୁଡ଼ିକ (ସମସ୍ତ ଆଣ୍ଟିପେରୋକ୍ସିଡେସ୍ ସମେତ) ପ୍ରକାଶନରେ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ପରିବର୍ତ୍ତନ ହୋଇନାହିଁ, ତେଣୁ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରୁଛି ଯେ ଏହି ମେଟାବୋଲିକ୍ ପୁନଃନିର୍ଦ୍ଦେଶନ ଅବନତ PN (ଚିତ୍ର S6, D ରୁ G) ପାଇଁ ଚୟନାତ୍ମକ।
ସଂକ୍ଷେପରେ, ଏହି ବିଶ୍ଳେଷଣଗୁଡ଼ିକ PNs ରେ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ମେଟାବୋଲିକ୍ ପଥଗୁଡ଼ିକର ସାମୟିକ ସକ୍ରିୟକରଣର ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ଭିନ୍ନ ଢାଞ୍ଚା ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲେ। ଯଦିଓ ଅସ୍ୱାଭାବିକ ନ୍ୟୁରୋନାଲ୍ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ କାର୍ଯ୍ୟ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଆଥେରୋସ୍କୋଲେରିସ୍ ଏବଂ 1C ପୁନଃନିର୍ମାଣ (ଚିତ୍ର 3E ଏବଂ ଚିତ୍ର S5C) ଆଡ଼କୁ ନେଇପାରେ, ଏବଂ I ଏବଂ IV ଜଟିଳର ପ୍ରକାଶନରେ ମଧ୍ୟ ପୂର୍ବାନୁମାନଯୋଗ୍ୟ ପରିବର୍ତ୍ତନ ହୋଇପାରେ, ସେରିନ୍ ଡି ନୋଭୋ ସଂଶ୍ଳେଷଣରେ ପରିବର୍ତ୍ତନ କେବଳ ଶେଷ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ସ୍ପଷ୍ଟ ହୋଇଥିଲା। OXPHOS ଡିସଫଙ୍କସନ୍ (ଚିତ୍ର 3E ଏବଂ ଚିତ୍ର S5C)। ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକ ଏକ କ୍ରମିକ ପ୍ରକ୍ରିୟାକୁ ପରିଭାଷିତ କରେ ଯେଉଁଥିରେ ଚାପ-ପ୍ରେରିତ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ (1C ଚକ୍ର) ଏବଂ ସାଇଟୋପ୍ଲାଜମିକ୍ (ସେରିନ୍ ବାୟୋସିନ୍ଥେସିସ୍) ନ୍ୟୁରୋନାଲ୍ ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ ପୁନଃଆକାର ଦେବା ପାଇଁ TCA ଚକ୍ରରେ ଏଥେରୋସ୍କୋଲେରିସ୍କୋଲେରିସ୍ ବୃଦ୍ଧି ସହିତ ସମନ୍ୱୟଶୀଳ ଭାବରେ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା କରେ।
8 ସପ୍ତାହ ବୟସର OXPHOS-ଅଭାବୀ PNଗୁଡ଼ିକ ଉଚ୍ଚ-ଆବୃତ୍ତି ଉତ୍ତେଜନା କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ବଜାୟ ରଖିପାରିବେ ଏବଂ ମାଇଟୋକୋଣ୍ଡ୍ରିଆଲ ଡିସଫଙ୍କସନ୍ ପାଇଁ କ୍ଷତିପୂରଣ ଦେବା ପାଇଁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ମେଟାବୋଲିକ୍ ପୁନଃସଂଯୋଗ କରିପାରିବେ। ଏହି ଆବିଷ୍କାର ଏକ ଆକର୍ଷଣୀୟ ସମ୍ଭାବନା ସୃଷ୍ଟି କରେ ଯେ ଏହି ମୁହୂର୍ତ୍ତରେ ମଧ୍ୟ, ଏହି କୋଷଗୁଡ଼ିକ ନ୍ୟୁରୋଡିଜେନେରେସନକୁ ବିଳମ୍ବ କିମ୍ବା ରୋକିବା ପାଇଁ ଚିକିତ୍ସାଗତ ହସ୍ତକ୍ଷେପ ଗ୍ରହଣ କରିପାରିବେ। ବିଳମ୍ବରେ। ଆମେ ଦୁଇଟି ସ୍ୱାଧୀନ ହସ୍ତକ୍ଷେପ ମାଧ୍ୟମରେ ଏହି ସମ୍ଭାବନାକୁ ସମାଧାନ କରିଛୁ। ପ୍ରଥମ ପଦ୍ଧତିରେ, ଆମେ ଏକ Cre-ନିର୍ଭରଶୀଳ ଆଡେନୋ-ସଂଯୁକ୍ତ ଭାଇରସ୍ (AAV) ଭେକ୍ଟର ଡିଜାଇନ୍ କରିଛୁ ଯାହା ଦ୍ଵାରା MFN2 କୁ OXPHOS-ଅଭାବୀ PNs in vivo (ଚିତ୍ର S7A) ରେ ଚୟନିତ ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରାଯାଇପାରିବ। AAV ଏନକୋଡିଂ MFN2 ଏବଂ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ ରିପୋର୍ଟର ଜିନ୍ mCherry (Mfn2-AAV) ପ୍ରାଥମିକ ନ୍ୟୁରନ୍ ସଂସ୍କୃତିରେ ଯାଞ୍ଚ କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା MFN2 କୁ Cre-ନିର୍ଭରଶୀଳ ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲା ​​ଏବଂ ମାଇଟୋକୋଣ୍ଡ୍ରିଆଲ ମର୍ଫୋଲୋଜିକୁ ଉଦ୍ଧାର କରିଥିଲା, ଯାହା ଦ୍ଵାରା Mfn2cKO ନ୍ୟୁରନ୍ (ଚିତ୍ର S7, B, D ଏବଂ E) ରେ ନ୍ୟୁରୋମ୍ୟୁଟେସନକୁ ରୋକିଥିଲା। ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ, ଆମେ 8 ସପ୍ତାହ ବୟସର Mfn2-AAV କୁ Mfn2cKO ର ସେରିବେଲାର କର୍ଟେକ୍ସ ଏବଂ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ମୂଷାକୁ ଷ୍ଟେରିଓଟାକ୍ଟିକାଲ ଭାବରେ ପ୍ରଦାନ କରିବା ପାଇଁ ଭିଭୋ ପରୀକ୍ଷଣ କରିଥିଲୁ ଏବଂ 12 ସପ୍ତାହ ବୟସର ମୂଷା (ଚିତ୍ର 4A) ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିଥିଲୁ। ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିବା Mfn2cKO ମୂଷା ମରିଯାଇଥିଲେ (ଚିତ୍ର 1, A ଏବଂ B) (16)। ଭିଭୋରେ ଭାଇରାଲ ଟ୍ରାନ୍ସଡକ୍ସନ ଫଳରେ କିଛି ସେରିବେଲାର ସର୍କଲରେ PN ର ଚୟନାତ୍ମକ ପ୍ରକାଶନ ହୋଇଥିଲା (ଚିତ୍ର S7, G ଏବଂ H)। କେବଳ mCherry (Ctrl-AAV) ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା ନିୟନ୍ତ୍ରଣ AAV ର ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ Mfn2cKO ପ୍ରାଣୀଙ୍କ ନ୍ୟୁରୋଡିଜେନେରେସନର ଡିଗ୍ରୀ ଉପରେ କୌଣସି ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପ୍ରଭାବ ପକାଇ ନଥିଲା। ବିପରୀତରେ, Mfn2-AAV ସହିତ ଟ୍ରାନ୍ସଡ୍ୟୁସ ହୋଇଥିବା Mfn2cKO ର ବିଶ୍ଳେଷଣ PN କୋଷ ସ୍ତରର ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ସୁରକ୍ଷା ପ୍ରଭାବ ଦେଖାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 4, B ଏବଂ C)। ବିଶେଷକରି, ନିୟନ୍ତ୍ରକ ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କଠାରୁ ନ୍ୟୁରନ୍ ଘନତା ପ୍ରାୟ ପୃଥକ ହୋଇପାରୁନଥିବା ପରି ମନେ ହେଉଛି (ଚିତ୍ର 4, B ଏବଂ C, ଏବଂ ଚିତ୍ର S7, H ଏବଂ I)। MFN1 ର ପ୍ରକାଶନ କିନ୍ତୁ MFN2 ନୁହେଁ, ନ୍ୟୁରୋନାଲ ମୃତ୍ୟୁକୁ ରକ୍ଷା କରିବାରେ ସମାନ ଭାବରେ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ (ଚିତ୍ର 4C ଏବଂ ଚିତ୍ର S7, C ଏବଂ F), ଯାହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ ଏକଟୋପିକ୍ MFN1 ର ପ୍ରକାଶନ MFN2 ର ଅଭାବକୁ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ଭାବରେ ପୂରଣ କରିପାରିବ। ଏକକ PN ସ୍ତରରେ ଅଧିକ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦେଖାଇଲା ଯେ Mfn2-AAV ମୁଖ୍ୟତଃ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆର ଅଲ୍ଟ୍ରାଷ୍ଟ୍ରକ୍ଚରକୁ ଉଦ୍ଧାର କରିଛି, mtDNA ସ୍ତରକୁ ସ୍ୱାଭାବିକ କରିଛି ଏବଂ ଆଣ୍ଟି-ଆଞ୍ଜିଓଜେନେସିସ୍ ମାର୍କର PCx (ଚିତ୍ର 4, C ରୁ E) ର ଉଚ୍ଚ ପ୍ରକାଶନକୁ ଓଲଟାଇ ଦେଇଛି। ବିଶ୍ରାମ ଅବସ୍ଥାରେ ଉଦ୍ଧାର କରାଯାଇଥିବା Mfn2cKO ମୂଷାର ଦୃଶ୍ୟ ନିରୀକ୍ଷଣ ଦେଖାଇଲା ଯେ ସେମାନଙ୍କର ପୋଜିସନ୍ ଏବଂ ମୋଟର ଲକ୍ଷଣ (S1 ରୁ S3 ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଗତି) ଉନ୍ନତ ହୋଇଛି। ଶେଷରେ, ଏହି ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡ଼ିକ ଦର୍ଶାଏ ଯେ OXPHOS ରେ ଗୁରୁତର ଭାବରେ ଅଭାବ ଥିବା PNs ରେ MFN2 ର ବିଳମ୍ବିତ ପୁନଃପ୍ରବର୍ତ୍ତନ mtDNA ବ୍ୟବହାରକୁ ଓଲଟାଇବା ଏବଂ ଆଥେରୋସ୍ଲେରୋସିକ ପ୍ରବର୍ତ୍ତନକୁ ପ୍ରେରଣା ଦେବା ପାଇଁ ଯଥେଷ୍ଟ, ଯାହା ଦ୍ଵାରା ଆକ୍ସନ୍ ଡିଜେନେରେସନ୍ ଏବଂ ଭିଭୋରେ ନ୍ୟୁରୋନାଲ ମୃତ୍ୟୁକୁ ରୋକିଥାଏ।
(କ) ସୂଚିତ ମେଟାବୋଲିକ୍ ପଥ ସକ୍ରିୟ ହେବା ସମୟରେ AAV ଏନକୋଡିଂ MFN2 ପାଇଁ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ସମୟସୂଚୀ ଦେଖାଉଥିବା ଏକ ଯୋଜନା। (ଖ) Mfn2cKO ମୂଷାରେ 8 ସପ୍ତାହରେ ଟ୍ରାନ୍ସଡ୍ୟୁସ୍ ହୋଇଥିବା 12-ସପ୍ତାହ ପୁରୁଣା ସେରେବେଲାର ସ୍ଲାଇସର ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କନଫୋକାଲ୍ ପ୍ରତିଛବି ଏବଂ ଆଣ୍ଟି-କାଲବିଣ୍ଡିନ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ଲେବଲ କରାଯାଇଛି। ଡାହାଣ: ଆକ୍ସନ୍ ଫାଇବରର ସ୍କେଲିଂ। ଆକ୍ସନ୍ ଜୁମ୍‌ର ସ୍କେଲ୍ ହେଉଛି 450 ଏବଂ 75 μm। (ଗ) ବାମ: AAV ଟ୍ରାନ୍ସଡକ୍ସନ୍ ଲୁପ୍ (AAV+) ରେ ପୁରକିଞ୍ଜେ କୋଷ ଘନତ୍ୱର ପରିମାଣ (ପରିବର୍ତ୍ତନର ଏକ-ପାର୍ଶ୍ଵ ବିଶ୍ଳେଷଣ; n = 3 ମୂଷା)। ଡାହାଣ: ସପ୍ତାହ 12 ରେ ଟ୍ରାନ୍ସଡ୍ୟୁସ୍ ହୋଇଥିବା PN ରେ mtDNA ଫୋକସ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ (ଅଣଯୋଡ଼ାଇ ଟି-ପରୀକ୍ଷା; ତିନୋଟି ମୂଷାରୁ n = 6 କୋଷ)। * P <0.05; ** P <0.01। (ଘ) ସୂଚିତ ଭାଇରାଲ୍ ଭେକ୍ଟର ସହିତ ଟ୍ରାନ୍ସଡ୍ୟୁସ୍ ହୋଇଥିବା Mfn2cKO ସେରେବେଲାର ସେକ୍ସନର PN ଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ ଟ୍ରାନ୍ସମିସନ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋନ୍ ମାଇକ୍ରୋଗ୍ରାଫ୍। ଗୋଲାପୀ ମାସ୍କ ଡେଣ୍ଡ୍ରାଇଟ୍ ଦ୍ୱାରା ଅଧିକୃତ କ୍ଷେତ୍ରକୁ ଦର୍ଶାଏ, ଏବଂ ହଳଦିଆ ବିନ୍ଦୁ ବର୍ଗ ଡାହାଣ ପାର୍ଶ୍ୱରେ ପ୍ରଦାନ କରାଯାଇଥିବା ଜୁମ୍ ଦର୍ଶାଏ; n ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସ୍ କୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ। ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 1μm। (E) 12 ସପ୍ତାହରେ ଟ୍ରାନ୍ସଡ୍ୟୁସ୍ ହୋଇଥିବା PN ରେ PCx ଷ୍ଟେନିଂର ଏକ ଉଦାହରଣ ଦର୍ଶାଏ। ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 20μm। OE, ଅତ୍ୟଧିକ ପ୍ରକାଶନ; FC, ଫୋଲ୍ଡ ପରିବର୍ତ୍ତନ।
ଶେଷରେ, ଆମେ OXPHOS ଡିସଫଙ୍କସନ୍ ଅନୁଭବ କରିଥିବା PN ଗୁଡ଼ିକରେ ପେରୋକ୍ସିଡେଜ୍-ପ୍ରେରିତ କୋଷ ବଞ୍ଚିବାର ଗୁରୁତ୍ୱ ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିଥିଲୁ। ଆମେ ବିଶେଷ ଭାବରେ ମାଉସ୍ PCx mRNA (AAV-shPCx) କୁ ଲକ୍ଷ୍ୟ କରି mCherry ଏନକୋଡିଂ AAV-shRNA (ସର୍ଟ ହେୟାରପିନ୍ RNA) ସୃଷ୍ଟି କରିଥିଲୁ, ଏବଂ Mfn2cKO ମୂଷାଙ୍କ ସେରେବେଲମ୍ ରେ ଭାଇରସ୍ କିମ୍ବା ଏହାର ସ୍କ୍ରାମ୍ବଲ୍ଡ୍ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ (AAV-scr) ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ କରିଥିଲୁ। PCx ପ୍ରକାଶନ ବୃଦ୍ଧି ପାଇବା (ଚିତ୍ର 3C) ଏବଂ PN କୋଷ ସ୍ତର ଏପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଅକ୍ଷୁର୍ଣ୍ଣ ଥିବା ସମୟରେ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ PCx ନକଡାଉନ୍ ହାସଲ କରିବା ପାଇଁ ବୟସର ଚତୁର୍ଥ ସପ୍ତାହରେ (ଚିତ୍ର 5A) ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ କରାଯାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 5A)। ଏହା ଲକ୍ଷ୍ୟ କରିବା ଯୋଗ୍ୟ ଯେ PCx (ଚିତ୍ର S8A) କୁ ଟାଣିବା ଦ୍ୱାରା PN ମୃତ୍ୟୁର ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ତ୍ୱରାନ୍ୱିତ ହୁଏ, ଯାହା ସଂକ୍ରମିତ ରିଙ୍ଗ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ସୀମିତ (ଚିତ୍ର 5, B ଏବଂ C)। PCx ଅପ-ରେଗୁଲେସନ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରେରିତ ମେଟାବୋଲିକ୍ ପ୍ରଭାବର କ୍ରିୟାବିଧି ବୁଝିବା ପାଇଁ, ଆମେ PCx ନକଡାଉନ୍ ପରେ PNs ର ରେଡକ୍ସ ସ୍ଥିତି ଅଧ୍ୟୟନ କରିଥିଲୁ ଏବଂ AAV-ମଧ୍ୟସ୍ଥ ଅପ୍ଟିକାଲ୍ ବାୟୋସେନ୍ସର Grx1-roGFP2 ଏକକାଳୀନ ପ୍ରକାଶିତ ହୋଇଥିଲା (ଚିତ୍ର S8, B ରୁ D) ଯାହା ଦ୍ୱାରା ଗ୍ଲୁଟାଥିଓନ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ରେଡକ୍ସ ସମ୍ଭାବନାର ଆପେକ୍ଷିକ ପରିବର୍ତ୍ତନ (38) ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରାଯାଇଥିଲା। ତାପରେ, ଆମେ FLIM ଅବସ୍ଥା (ଚିତ୍ର S8, E ରୁ G) ଯାଞ୍ଚ କରିବା ପରେ ସାଇଟୋପ୍ଲାଜମିକ୍ ରେଡକ୍ସ ସ୍ଥିତିରେ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ପରିବର୍ତ୍ତନ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ 7 ସପ୍ତାହ ପୁରୁଣା Mfn2cKO କିମ୍ବା ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଲିଟରମେଟ୍ସର ତୀବ୍ର ମସ୍ତିଷ୍କ ସ୍ଲାଇସରେ ଦୁଇ-ଫୋଟନ୍ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ଲାଇଫଟାଇମ୍ ଇମେଜିଂ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି (FLIM) କରିଥିଲୁ। ବିଶ୍ଳେଷଣ PCx ପ୍ରକାଶନ ଅଭାବ ଥିବା ଏକକ Mfn2cKO PNs ର ଅକ୍ସିଡେସନ ଅବସ୍ଥାରେ ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ବୃଦ୍ଧି ଦେଖାଇଥିଲା, ଯାହା ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ନ୍ୟୁରନ୍ କିମ୍ବା Mfn2cKO PNs ଠାରୁ ଭିନ୍ନ ଯାହା କେବଳ ସ୍କ୍ରାମ୍ବଲ୍ shRNA ପ୍ରକାଶ କରେ (ଚିତ୍ର 5, D ଏବଂ E)। ଯେତେବେଳେ PCx ପ୍ରକାଶନକୁ ନିମ୍ନ-ନିୟନ୍ତ୍ରିତ କରାଯାଇଥିଲା, ସେତେବେଳେ ଅତ୍ୟଧିକ ଅକ୍ସିଡାଇଜ୍ ହୋଇଥିବା ଅବସ୍ଥା ଦେଖାଉଥିବା Mfn2cKO PN ଗୁଡ଼ିକର ଶତକଡ଼ା ତିନି ଗୁଣରୁ ଅଧିକ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଲା (ଚିତ୍ର 5E), ଯାହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ PCx ଅପ୍-ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଅବନତ ନ୍ୟୁରନ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ରେଡକ୍ସ କ୍ଷମତାକୁ ବଜାୟ ରଖିଥିଲା।
(A) ସୂଚିତ ମେଟାବୋଲିକ୍ ପଥ ସକ୍ରିୟ ହେବା ସମୟରେ AAV ଏନକୋଡିଂ shPCx ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ପାଇଁ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ସମୟସୂଚୀ ଦେଖାଉଥିବା ଏକ ଯୋଜନା। (B) Mfn2cKO ମୂଷାରେ 8 ସପ୍ତାହ ବୟସ୍କ ସେରେବେଲାର ଅଂଶର ପ୍ରତିନିଧି କନଫୋକାଲ୍ ଫଟୋଗ୍ରାଫ୍ 4 ସପ୍ତାହରେ ଆଣ୍ଟି-କ୍ୟାଲସିନ୍ୟୁରିନ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ଟ୍ରାନ୍ସଡ୍ୟୁସ୍ ଏବଂ ଲେବଲ୍ କରାଯାଇଛି। ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 450μm। (C) AAV-ଟ୍ରାନ୍ସଡ୍ୟୁସ୍ ଲୁପ୍ସରେ ପୁରକିଞ୍ଜେ କୋଷ ଘନତ୍ୱର ପରିମାଣ (ପରିବର୍ତ୍ତନର ଏକ-ପାଖ ବିଶ୍ଳେଷଣ; n = 3 ରୁ 4 ମୂଷା)। ତଥ୍ୟକୁ ମଧ୍ୟମ ± SEM ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରାଯାଇଛି; ***P<0.001। (D) ପ୍ରତିନିଧି FLIM ଚିତ୍ର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ପରିସ୍ଥିତିରେ 7 ସପ୍ତାହ ବୟସ୍କ PN ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା ଗ୍ଲୁଟାଥିଓନ୍ ରେଡକ୍ସ ସେନ୍ସର Grx1-roGFP2 ର ହାରାହାରି ଜୀବନକାଳ ଦେଖାଉଛି। LUT (ଲୁକ୍-ଅପ୍ ଟେବୁଲ୍) ଅନୁପାତ: ବଞ୍ଚିବା ସମୟ ବ୍ୟବଧାନ (ପିକୋସେକେଣ୍ଡରେ)। ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 25μm। (E) ହିଷ୍ଟୋଗ୍ରାମଟି (D) ରୁ Grx1-roGFP2 ଜୀବନକାଳ ମୂଲ୍ୟର ବଣ୍ଟନ ଦେଖାଏ (n=158 ରୁ 368 କୋଷ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଦୁଇଟି ମୂଷାରେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଅବସ୍ଥା ଅଧୀନରେ)। ପ୍ରତ୍ୟେକ ହିଷ୍ଟୋଗ୍ରାମ ଉପରେ ଥିବା ପାଇ ଚାର୍ଟ: ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ଲମ୍ବା (ଲାଲ, ଅକ୍ସିଡାଇଜ୍ଡ) କିମ୍ବା ଛୋଟ (ନୀଳ, ହ୍ରାସ) ଜୀବନକାଳ ମୂଲ୍ୟ ସହିତ କୋଷଗୁଡ଼ିକର ସଂଖ୍ୟା ଦେଖାଏ, ଯାହା CTRL-AAV-scr ରେ ହାରାହାରି ଜୀବନକାଳ ମୂଲ୍ୟର 1 SD ଅତିକ୍ରମ କରେ। (F) ପ୍ରସ୍ତାବିତ ମଡେଲଟି ନ୍ୟୁରୋନାଲ PCx ର ଉପନିୟନ୍ତ୍ରଣର ସୁରକ୍ଷା ପ୍ରଭାବ ଦେଖାଏ।
ସର୍ବମୋଟ, ଆମେ ଏଠାରେ ପ୍ରଦାନ କରୁଥିବା ତଥ୍ୟ ଦର୍ଶାଉଛି ଯେ MFN2 ର ପୁନଃ-ପ୍ରକାଶନ ଗୁରୁତର OXPHOS ଅଭାବ, ଗୁରୁତର mtDNA ହ୍ରାସ ଏବଂ ଅତ୍ୟନ୍ତ ଅସ୍ୱାଭାବିକ ଇଷ୍ଟା-ପରି ଆକୃତି ସହିତ ଉନ୍ନତ PN କୁ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଭାବରେ ଉଦ୍ଧାର କରିପାରିବ, ଯାହା ଦ୍ଵାରା ଉନ୍ନତ ରୋଗରେ ମଧ୍ୟ ନିରନ୍ତର ପ୍ରଗତି ପ୍ରଦାନ କରେ। ନ୍ୟୁରୋଡିଜେନେରେସନ୍ କୋଷ ମୃତ୍ୟୁ ପୂର୍ବରୁ ପର୍ଯ୍ୟାୟର ପ୍ରତିବର୍ତ୍ତନୀୟ ପ୍ରମାଣ ପ୍ରଦାନ କରେ। ମେଟାବୋଲିକ୍ ନମନୀୟତାର ଏହି ଡିଗ୍ରୀକୁ ଆଥେରୋସ୍ଲେରୋସିସ୍ (TCA ଚକ୍ରର ଏକ ପୁନଃୱାଇରିଂ) ପ୍ରେରଣା ଦେବା ପାଇଁ ନ୍ୟୁରନଗୁଡ଼ିକର କ୍ଷମତା ଦ୍ୱାରା ଆହୁରି ଗୁରୁତ୍ୱ ଦିଆଯାଇଛି, ଯାହା OXPHOS ଅଭାବ ଥିବା PN ଗୁଡ଼ିକରେ PCx ପ୍ରକାଶନକୁ ବାଧା ଦିଏ ଏବଂ କୋଷ ମୃତ୍ୟୁକୁ ବୃଦ୍ଧି କରେ, ଯାହା ଦ୍ଵାରା ଏକ ସୁରକ୍ଷାମୂଳକ ଭୂମିକା ଗ୍ରହଣ କରେ (ଚିତ୍ର 5F)।
ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ, ଆମେ ପ୍ରମାଣ ପ୍ରଦାନ କରିଛୁ ଯେ OXPHOS ଡିସଫଙ୍କସନ୍ ପ୍ରତି PN ଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ହେଉଛି ମେଟାବୋଲିକ୍ ପ୍ରୋଗ୍ରାମ୍ ଦ୍ୱାରା ସକ୍ରିୟ ହୋଇଥିବା ଡିଫରେନ୍ସିଆଲ୍ ଆଥେରେକ୍ଲୋରୋସିସ୍ ମାଧ୍ୟମରେ ଧୀରେ ଧୀରେ TCA ଚକ୍ର ଆଥେରେକ୍ଲୋରୋସିସ୍ ରେ ଏକତ୍ରିତ ହେବା। ଆମେ ଅନେକ ପରିପୂରକ ପଦ୍ଧତି ସହିତ ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରିଛୁ ଏବଂ ପ୍ରକାଶ କରିଛୁ ଯେ ଯେତେବେଳେ ଗମ୍ଭୀର ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଡିସଫଙ୍କସନ୍ ଦ୍ୱାରା ଚ୍ୟାଲେଞ୍ଜ କରାଯାଏ, ସେତେବେଳେ ନ୍ୟୁରନ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ମେଟାବୋଲିକ୍ ଇଲାଷ୍ଟିସିଟିର ଏକ ପୂର୍ବରୁ ଅଜଣା ରୂପ ଥାଏ। ଆମକୁ ଆଶ୍ଚର୍ଯ୍ୟ ଲାଗୁଛି ଯେ, ସମଗ୍ର ପୁନଃୱାୟାରିଂ ପ୍ରକ୍ରିୟା ଆବଶ୍ୟକ ଭାବରେ ନ୍ୟୁରୋଡିଜେନେରେସନ୍ ସହିତ ଧୀରେ ଧୀରେ ଏବଂ ଅପରିବର୍ତ୍ତନୀୟ ଭାବରେ ଟର୍ମିନାଲ୍ ମେଟାବୋଲିକ୍ ଅବସ୍ଥାକୁ ଚିହ୍ନିତ କରେ ନାହିଁ, କିନ୍ତୁ ଆମର ତଥ୍ୟ ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ ଏହା କୋଷ ମୃତ୍ୟୁ ପୂର୍ବରୁ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ମଧ୍ୟ ଏକ ରକ୍ଷଣାବେକ୍ଷଣ ନ୍ୟୁରନ୍ ଗଠନ କରିପାରେ। କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ କ୍ଷତିପୂରଣ ଯନ୍ତ୍ର। ଏହି ସନ୍ଧାନ ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ ନ୍ୟୁରନ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ଶରୀରରେ ମେଟାବୋଲିକ୍ ପ୍ଲାଷ୍ଟିସିଟିର ଯଥେଷ୍ଟ ପରିମାଣ ଅଛି। ଏହି ତଥ୍ୟ ପ୍ରମାଣ କରେ ଯେ MFN2 ର ପରବର୍ତ୍ତୀ ପୁନଃପ୍ରବର୍ତ୍ତନ ମୁଖ୍ୟ ମେଟାବୋଲିକ୍ ମାର୍କରଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରକାଶନକୁ ଓଲଟାଇପାରେ ଏବଂ PN ଡିଜେନେରେସନ୍ କୁ ରୋକିପାରେ। ବିପରୀତରେ, ଏହା ଏଥେରେକ୍ଲୋରୋସିସ୍ କୁ ବାଧା ଦିଏ ଏବଂ ସ୍ନାୟୁକୁ ତ୍ୱରାନ୍ୱିତ କରେ।
ଆମ ଗବେଷଣାର ସବୁଠାରୁ ଆକର୍ଷଣୀୟ ତଥ୍ୟ ମଧ୍ୟରୁ ଗୋଟିଏ ହେଉଛି ଯେ OXPHOS ଅଭାବୀ PNs ବିଶେଷ ଭାବରେ ଆର୍ଟେରିଓସ୍କ୍ଲେରୋସିସ୍କୁ ଉତ୍ତେଜିତ କରୁଥିବା ଏନଜାଇମଗୁଡ଼ିକୁ ଅପ-ନିୟନ୍ତ୍ରିତ କରି TCA ଚକ୍ର ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରିପାରିବ। ମେଟାବୋଲିକ୍ ପୁନଃସଂସ୍ଥାପନ ହେଉଛି କର୍କଟ କୋଷଗୁଡ଼ିକର ଏକ ସାଧାରଣ ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟ, ଯାହା ମଧ୍ୟରୁ କିଛି ଗ୍ଲୁଟାମାଇନ୍ ଉପରେ ନିର୍ଭର କରନ୍ତି ଯାହା TCA ଚକ୍ର ମଧ୍ୟସ୍ଥିକୁ ପୂର୍ଣ୍ଣ କରି ହ୍ରାସକାରୀ ସମକକ୍ଷ ଉତ୍ପାଦନ କରନ୍ତି, ଯାହା ଶ୍ୱାସକ୍ରିୟା ଶୃଙ୍ଖଳକୁ ଚଳାଏ ଏବଂ ଲିପିଡ୍ ଏବଂ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ ଜୈବସଂଶ୍ଳେଷଣ ପୂର୍ବକ ଉତ୍ପାଦନ ବଜାୟ ରଖେ (39, 40)। ଏକ ସାମ୍ପ୍ରତିକ ଅଧ୍ୟୟନରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ OXPHOS ଡିସଫଙ୍କସନ୍ ଅନୁଭବ କରୁଥିବା ପେରିଫେରାଲ୍ ଟିସୁଗୁଡ଼ିକରେ, ଗ୍ଲୁଟାମାଇନ୍/ଗ୍ଲୁଟାମେଟ୍ ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ ର ପୁନଃସଂଯୋଗ ମଧ୍ୟ ଏକ ପ୍ରମୁଖ ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟ (5, 41), ଯେଉଁଠାରେ TCA ଚକ୍ରରେ ଗ୍ଲୁଟାମାଇନ୍ ପ୍ରବେଶର ଦିଗ OXPHOS ଆଘାତର ଗମ୍ଭୀରତା ଯୋଗୁଁ ନିର୍ଭର କରେ (41)। ତଥାପି, ଶରୀରରେ ନ୍ୟୁରୋନାଲ୍ ମେଟାବୋଲିକ୍ ପ୍ଲାଷ୍ଟିସିଟିର କୌଣସି ସମାନତା ଏବଂ ରୋଗ ପ୍ରସଙ୍ଗରେ ଏହାର ସମ୍ଭାବ୍ୟ ପ୍ରାସଙ୍ଗିକତା ଉପରେ ସ୍ପଷ୍ଟ ପ୍ରମାଣର ଅଭାବ ଅଛି। ଏକ ସାମ୍ପ୍ରତିକ ଇନ ଭିଟ୍ରୋ ଅଧ୍ୟୟନରେ, ପ୍ରାଥମିକ କର୍ଟିକାଲ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ ନ୍ୟୁରୋଟ୍ରାନ୍ସମିସନ୍ ପାଇଁ ଗ୍ଲୁଟାମେଟ୍ ପୁଲ୍ ପରିଚାଳନା କରୁଥିବା ଦେଖାଯାଇଥିଲା, ଯାହା ଦ୍ଵାରା ମେଟାବୋଲିକ୍ ଚାପ ପରିସ୍ଥିତିରେ ଅକ୍ସିଡେଟିଭ୍ ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ ଏବଂ ଏଥେରାସ୍ଲୋରୋସିସ୍କୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରିଥାଏ (42)। ଏହା ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଯେ TCA ଚକ୍ର ଏନଜାଇମ ସକ୍ସିନେଟ୍ ଡିହାଇଡ୍ରୋଜେନେଜର ଔଷଧୀୟ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ଅଧୀନରେ, ପାଇରୁଭେଟ୍ କାର୍ବୋକ୍ସିଲେସନ୍ କଲଚର୍ଡ ସେରେବେଲାର୍ ଗ୍ରାନୁଲ୍ ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ଅକ୍ସାଲୋଏସେଟେଟ୍‌ର ସଂଶ୍ଳେଷଣକୁ ବଜାୟ ରଖିଥାଏ ବୋଲି ବିଶ୍ୱାସ କରାଯାଏ (34)। ତଥାପି, ମସ୍ତିଷ୍କ ଟିସୁ (ଯେଉଁଠାରେ ଏଥେରୋସ୍କ୍ଲୋରୋସିସ୍ ମୁଖ୍ୟତଃ ଆଷ୍ଟ୍ରୋସାଇଟ୍‌ ମଧ୍ୟରେ ସୀମିତ ବୋଲି ବିଶ୍ୱାସ କରାଯାଏ) ପାଇଁ ଏହି ଯନ୍ତ୍ରଗୁଡ଼ିକର ଶାରୀରିକ ପ୍ରାସଙ୍ଗିକତା ଏବେ ବି ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଶାରୀରିକ ଗୁରୁତ୍ୱ (43) ରହିଛି। ଏହି କ୍ଷେତ୍ରରେ, ଆମର ତଥ୍ୟ ଦର୍ଶାଉଛି ଯେ ଶରୀରରେ OXPHOS ଦ୍ୱାରା କ୍ଷତିଗ୍ରସ୍ତ PNଗୁଡ଼ିକୁ BCAA ଅବନତି ଏବଂ ପାଇରୁଭେଟ୍ କାର୍ବୋକ୍ସିଲେସନ୍‌କୁ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରାଯାଇପାରିବ, ଯାହା TCA ପୁଲ୍ ମଧ୍ୟବର୍ତ୍ତୀଙ୍କ ପରିପୂରକର ଦୁଇଟି ମୁଖ୍ୟ ଉତ୍ସ। ଯଦିଓ ନ୍ୟୁରୋନାଲ୍ ଶକ୍ତି ମେଟାବୋଲିଜିମ୍‌ରେ BCAA କ୍ୟାଟାବୋଲିଜିମ୍‌ର ପୁଟେଟିଭ୍ ଅବଦାନ ପ୍ରସ୍ତାବିତ କରାଯାଇଛି, ନ୍ୟୁରୋଟ୍ରାନ୍ସମିସନ୍ ପାଇଁ ଗ୍ଲୁଟାମେଟ୍ ଏବଂ GABA ର ଭୂମିକା ବ୍ୟତୀତ (44), ଭିଭୋରେ ଏହି ଯନ୍ତ୍ରଗୁଡ଼ିକର କୌଣସି ପ୍ରମାଣ ନାହିଁ। ତେଣୁ, ଏହା ଅନୁମାନ କରିବା ସହଜ ଯେ ଅକାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ PNଗୁଡ଼ିକ ଆଥେରୋସ୍କ୍ଲୋରୋସିସ୍ ବୃଦ୍ଧି କରି ଆସିମିଲେସନ୍ ପ୍ରକ୍ରିୟା ଦ୍ୱାରା ଚାଳିତ TCA ମଧ୍ୟବର୍ତ୍ତୀଙ୍କ ବ୍ୟବହାର ପାଇଁ ସ୍ୱୟଂଚାଳିତ ଭାବରେ କ୍ଷତିପୂରଣ ଦେଇପାରେ। ବିଶେଷକରି, ଆସ୍ପାର୍ଟିକ୍ ଏସିଡର ବର୍ଦ୍ଧିତ ଚାହିଦା ବଜାୟ ରଖିବା ପାଇଁ PCXର ଅପରେଗୁଲେସନ୍ ଆବଶ୍ୟକ ହୋଇପାରେ, ଯାହା ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଡିସଫଙ୍କସନ୍ ସହିତ ପ୍ରସାରିତ କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ପରାମର୍ଶ ଦିଆଯାଏ (45)। ତଥାପି, ଆମର ମେଟାବୋଲୋମିକ୍ସ ବିଶ୍ଳେଷଣ Mfn2cKO PNs (ଚିତ୍ର S6A) ରେ ଆସ୍ପାର୍ଟିକ୍ ଏସିଡର ସ୍ଥିର-ସ୍ଥିତି ସ୍ତରରେ କୌଣସି ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପରିବର୍ତ୍ତନ ପ୍ରକାଶ କରିନାହିଁ, ଯାହା ସମ୍ଭବତଃ ପ୍ରସାରିତ କୋଷ ଏବଂ ପୋଷ୍ଟ-ମାଇଟୋଟିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ ମଧ୍ୟରେ ଆସ୍ପାର୍ଟିକ୍ ଏସିଡର ଭିନ୍ନ ମେଟାବୋଲିକ୍ ବ୍ୟବହାରକୁ ପ୍ରତିଫଳିତ କରେ। ଯଦିଓ ଭିଭୋରେ ଅକ୍ଷମ ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ PCX ଅପରେଗୁଲେସନ୍‌ର ସଠିକ୍ କ୍ରିୟାବିଧି ବର୍ଣ୍ଣିତ ହେବା ବାକି ଅଛି, ଆମେ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରିଛୁ ଯେ ଏହି ଅକାଳ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ନ୍ୟୁରନ୍‌ର ରେଡକ୍ସ ଅବସ୍ଥା ବଜାୟ ରଖିବାରେ ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଭୂମିକା ଗ୍ରହଣ କରେ, ଯାହା ସେରେବେଲାର୍ ସ୍ଲାଇସ୍‌ରେ FLIM ପରୀକ୍ଷଣରେ ପ୍ରଦର୍ଶିତ ହୋଇଥିଲା। ବିଶେଷକରି, PCXକୁ ଅପରେଗୁଲେସନ୍ କରିବାରୁ PNଗୁଡ଼ିକୁ ରୋକିବା ଅଧିକ ଅକ୍ସିଡାଇଜ୍ ହୋଇଥିବା ଅବସ୍ଥାକୁ ନେଇପାରେ ଏବଂ କୋଷ ମୃତ୍ୟୁକୁ ତ୍ୱରାନ୍ୱିତ କରିପାରେ। BCAA ଅବକ୍ଷୟର ସକ୍ରିୟକରଣ ଏବଂ ପାଇରୁଭେଟର କାର୍ବୋକ୍ସିଲେସନ୍ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଡିସଫଙ୍କସନ୍ (7) ର ପରିଧିୟ ଟିସୁଗୁଡ଼ିକୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ କରିବାର ଉପାୟ ନୁହେଁ। ତେଣୁ, ସେମାନେ OXPHOS-ଅଭାବୀ ନ୍ୟୁରନ୍‌ର ଏକ ପ୍ରାଥମିକତା ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟ ପରି ମନେହୁଏ, ଯଦିଓ ଏହା ଏକମାତ୍ର ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟ ନୁହେଁ, ଯାହା ନ୍ୟୁରୋଡିଜେନେରେସନ୍ ପାଇଁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ।
ସେରେବେଲାର ରୋଗ ଏକ ବିବିଧ ପ୍ରକାରର ନ୍ୟୁରୋଡିଜେନେରେଟିଭ୍ ରୋଗ ଯାହା ସାଧାରଣତଃ ଆଟାକ୍ସିଆ ଭାବରେ ପ୍ରକାଶିତ ହୁଏ ଏବଂ ପ୍ରାୟତଃ PNs କୁ କ୍ଷତି ପହଞ୍ଚାଏ (46)। ଏହି ନ୍ୟୁରନ୍ ଜନସଂଖ୍ୟା ବିଶେଷ ଭାବରେ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଡିସଫଙ୍କସନ୍ ପ୍ରତି ଦୁର୍ବଳ କାରଣ ମୂଷାରେ ସେମାନଙ୍କର ଚୟନାତ୍ମକ ଅବକ୍ଷୟ ମାନବ ସ୍ପିନୋସେରେବେଲାର ଆଟାକ୍ସିଆ (16, 47, 48) କୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ କରୁଥିବା ଅନେକ ମୋଟର ଲକ୍ଷଣକୁ ପୁନଃଉତ୍ପାଦନ କରିବା ପାଇଁ ଯଥେଷ୍ଟ। ରିପୋର୍ଟ ଅନୁଯାୟୀ, ଏକ ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ ଜିନ୍ ସହିତ ଏକ ଟ୍ରାନ୍ସଜେନିକ୍ ମାଉସ୍ ମଡେଲ୍ ମାନବ ସ୍ପିନୋସେରେବେଲାର ଆଟାକ୍ସିଆ ସହିତ ଜଡିତ ଏବଂ ଏଥିରେ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଡିସଫଙ୍କସନ୍ (49, 50) ଅଛି, ଯାହା PNPH ରେ OXPHOS ଅଭାବର ପରିଣାମ ଅଧ୍ୟୟନର ଗୁରୁତ୍ୱ ଉପରେ ଗୁରୁତ୍ୱାରୋପ କରେ। ତେଣୁ, ଏହି ଅନନ୍ୟ ନ୍ୟୁରନ୍ ଜନସଂଖ୍ୟାକୁ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ଭାବରେ ପୃଥକ କରିବା ଏବଂ ଅଧ୍ୟୟନ କରିବା ପାଇଁ ଏହା ବିଶେଷ ଉପଯୁକ୍ତ। ତଥାପି, PNs ଚାପ ପ୍ରତି ଅତ୍ୟନ୍ତ ସମ୍ବେଦନଶୀଳ ଏବଂ ସମଗ୍ର ସେରେବେଲାର କୋଷ ଜନସଂଖ୍ୟାର ଏକ କମ୍ ଅନୁପାତ ପାଇଁ ହିସାବ କରୁଥିବାରୁ, ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ କୋଷ ଭାବରେ ସେମାନଙ୍କୁ ଚୟନାତ୍ମକ ପୃଥକୀକରଣ କରିବା ଏକ ଚ୍ୟାଲେଞ୍ଜିଂ ଦିଗ। ଯଦିଓ ଅନ୍ୟ କୋଷ ପ୍ରକାରର (ବିଶେଷକରି ବୟସ୍କ ଟିସୁ) ପ୍ରଦୂଷଣର ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଅଭାବ ହାସଲ କରିବା ପ୍ରାୟ ଅସମ୍ଭବ, ଆମେ ଡାଉନଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ସ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ଯଥେଷ୍ଟ ସଂଖ୍ୟକ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ନ୍ୟୁରନ୍ ପାଇବା ପାଇଁ FACS ସହିତ ଏକ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ବିଚ୍ଛିନ୍ନତା ପଦକ୍ଷେପକୁ ମିଶ୍ରଣ କରିଥିଲୁ, ଏବଂ ସମଗ୍ର ସେରେବେଲମ୍ (51) ର ବିଦ୍ୟମାନ ଡାଟା ସେଟ୍ ତୁଳନାରେ ବହୁତ ଉଚ୍ଚ ପ୍ରୋଟିନ୍ କଭରେଜ୍ (ପ୍ରାୟ 3000 ପ୍ରୋଟିନ୍) ପାଇଥିଲୁ। ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ କୋଷଗୁଡ଼ିକର କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମତା ସଂରକ୍ଷଣ କରି, ଆମେ ଏଠାରେ ପ୍ରଦାନ କରୁଥିବା ପଦ୍ଧତି ଆମକୁ କେବଳ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆରେ ମେଟାବୋଲିକ୍ ପଥଗୁଡ଼ିକରେ ପରିବର୍ତ୍ତନ ଯାଞ୍ଚ କରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ ନାହିଁ, ବରଂ ଏହାର ସାଇଟୋପ୍ଲାଜମିକ୍ ପ୍ରତିପକ୍ଷଗୁଡ଼ିକରେ ପରିବର୍ତ୍ତନ ଯାଞ୍ଚ କରିବାକୁ ମଧ୍ୟ ଅନୁମତି ଦିଏ, ଯାହା କୋଷ ପ୍ରକାରକୁ ସମୃଦ୍ଧ କରିବା ପାଇଁ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆ ମେମ୍ବ୍ରାନ୍ ଟ୍ୟାଗ୍ ବ୍ୟବହାରକୁ ପରିପୂରକ କରେ। ଜଟିଳ ଟିସୁରେ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆ ସଂଖ୍ୟା ପାଇଁ ନୂତନ ପଦ୍ଧତି (52, 53)। ଆମେ ବର୍ଣ୍ଣନା କରୁଥିବା ପଦ୍ଧତି କେବଳ ପୁରକିଞ୍ଜେ କୋଷଗୁଡ଼ିକର ଅଧ୍ୟୟନ ସହିତ ଜଡିତ ନୁହେଁ, ବରଂ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ ଡିସଫଙ୍କସନ୍ ର ଅନ୍ୟ ମଡେଲ୍ ସମେତ ରୋଗଗ୍ରସ୍ତ ମସ୍ତିଷ୍କରେ ମେଟାବୋଲିକ୍ ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡ଼ିକୁ ସମାଧାନ କରିବା ପାଇଁ ଯେକୌଣସି ପ୍ରକାରର କୋଷରେ ସହଜରେ ପ୍ରୟୋଗ କରାଯାଇପାରିବ।
ଶେଷରେ, ଆମେ ଏହି ମେଟାବୋଲିକ୍ ପୁନର୍ବିନ୍ୟାସ ପ୍ରକ୍ରିୟା ସମୟରେ ଏକ ଚିକିତ୍ସାଗତ ୱିଣ୍ଡୋ ଚିହ୍ନଟ କରିଛୁ ଯାହା କୋଷୀୟ ଚାପର ମୁଖ୍ୟ ଲକ୍ଷଣଗୁଡ଼ିକୁ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଭାବରେ ଓଲଟାଇ ଦେଇପାରେ ଏବଂ ନ୍ୟୁରୋନାଲ୍ ଅବକ୍ଷୟକୁ ରୋକିପାରେ। ତେଣୁ, ଏଠାରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ପୁନଃୱାଇରିଂର କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ପ୍ରଭାବକୁ ବୁଝିବା ଦ୍ୱାରା ମାଇଟୋଚୋଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଡିସଫଙ୍କସନ୍ ସମୟରେ ନ୍ୟୁରୋନାଲ୍ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମତା ବଜାୟ ରଖିବା ପାଇଁ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଚିକିତ୍ସା ବିଷୟରେ ମୌଳିକ ଅନ୍ତର୍ଦୃଷ୍ଟି ମିଳିପାରେ। ଅନ୍ୟ ମସ୍ତିଷ୍କ କୋଷ ପ୍ରକାରରେ ଶକ୍ତି ମେଟାବୋଲିଜିମ୍‌ରେ ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡ଼ିକୁ ବିଚ୍ଛେଦ କରିବା ପାଇଁ ଭବିଷ୍ୟତ ଗବେଷଣା ଆବଶ୍ୟକ, ଯାହା ଦ୍ୱାରା ଏହି ନୀତିର ଅନ୍ୟ ସ୍ନାୟୁ ରୋଗ ପାଇଁ ପ୍ରଯୁଜ୍ୟତା ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ ପାଇବ।
MitoPark ମୂଷା ବିଷୟରେ ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣନା କରାଯାଇଛି (31)। loxP ଫ୍ଲାଙ୍କିଂ Mfn2 ଜିନ୍ ସହିତ C57BL/6N ମୂଷା ବିଷୟରେ ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣନା କରାଯାଇଛି (18) ଏବଂ L7-Cre ମୂଷା ସହିତ କ୍ରସ୍ କରାଯାଇଛି (23)। ଫଳରେ ଡବଲ୍ ହେଟେରୋଜାଇଗସ୍ ବଂଶକୁ ତା'ପରେ ହୋମୋଜାଇଗସ୍ Mfn2loxP/Mfn2loxP ମୂଷା ସହିତ କ୍ରସ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) ପାଇଁ ପୁରକିଞ୍ଜେ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଜିନ୍ ନକଆଉଟ୍ ସୃଷ୍ଟି କରିଥିଲା। ମିଳନର ଏକ ସବସେଟରେ, Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP ଆଲିଲ୍ (ଷ୍ଟପ୍-mtYFP) ଅତିରିକ୍ତ କ୍ରସିଂ (20) ମାଧ୍ୟମରେ ପ୍ରଚଳନ କରାଯାଇଥିଲା। ସମସ୍ତ ପ୍ରାଣୀ ପ୍ରକ୍ରିୟା ୟୁରୋପୀୟ, ଜାତୀୟ ଏବଂ ପ୍ରତିଷ୍ଠାନୀୟ ନିର୍ଦ୍ଦେଶାବଳୀ ଅନୁସାରେ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଜର୍ମାନୀର ଉତ୍ତର ରାଇନ-ୱେଷ୍ଟଫାଲିଆର ଉମୱେଲ୍ଟ ଏବଂ ଭର୍ବ୍ରାଉଚରସ୍ଚୁଟ୍ଜର ଲ୍ୟାଣ୍ଡେସାମଟ୍ଫୁର୍ନାଟୁର ଲ୍ୟାଣ୍ଡେସାମଟ୍ଫୁର୍ନାଟୁର ଦ୍ୱାରା ଅନୁମୋଦିତ ହୋଇଥିଲା। ପ୍ରାଣୀ କାର୍ଯ୍ୟ ମଧ୍ୟ ୟୁରୋପୀୟ ଲାବୋରେଟୋରୀ ପଶୁ ବିଜ୍ଞାନ ସଂଘର ମାର୍ଗଦର୍ଶନ ଅନୁସରଣ କରେ।
ଗର୍ଭବତୀ ମହିଳାଙ୍କ ସର୍ଭାଇକାଲ୍ ଡିସଲୋକେସନ୍ ନିଶ୍ଚେତକ ଦେବା ପରେ, ମୂଷା ଭ୍ରୁଣକୁ ପୃଥକ କରାଯାଏ (E13)। କର୍ଟେକ୍ସକୁ ହାଙ୍କସ୍ ବାଲାନ୍ସଡ୍ ଲବଣ ସମାଧାନ (HBSS) ରେ 10 mM ହେପ୍ସ ସହିତ ପରିପୂରକ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଡଲବେକୋଙ୍କ ମଡିଫାଏଡ୍ ଇଗଲ୍ସ ମାଧ୍ୟମକୁ ପାପେନ୍ (20 U/ml) ଏବଂ ସିଷ୍ଟାଇନ୍ (1μg/ml) ଧାରଣ କରାଯାଇଥିଲା। ଟିସୁକୁ DMEM ରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ ଏବଂ ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ପାଚନ ଦ୍ୱାରା ଏହାକୁ ବିଚ୍ଛିନ୍ନ କରନ୍ତୁ। Ml) 37°C ରେ 20 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ, ଏବଂ ତାପରେ 10% ଭ୍ରୁଣ ବୋଭାଇନ୍ ସେରମ୍ ସହିତ ପରିପୂରକ DMEM ରେ ଯାନ୍ତ୍ରିକ ଭାବରେ ମିଲ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ଇମେଜିଂ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ପ୍ରତି 6 ସେମି କଲଚର୍ ଡିସ୍ ରେ 2×106 ଘନତାରେ କିମ୍ବା 0.5×105 କୋଷ/cm2 ଘନତାରେ ପଲିଲାଇସିନ୍ ସହିତ ଆବୃତ କାଚ କଭରସ୍ଲିପ୍ ଉପରେ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ବିଭକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା। 4 ଘଣ୍ଟା ପରେ, ମାଧ୍ୟମକୁ 1% B27 ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟ ଏବଂ 0.5 mM ଗ୍ଲୁଟାମ୍ୟାକ୍ସ ଧାରଣ କରୁଥିବା ନ୍ୟୁରୋବାସାଲ୍ ସେରମ୍-ମୁକ୍ତ ମାଧ୍ୟମ ସହିତ ବଦଳାଯାଇଥିଲା। ପରୀକ୍ଷଣ ସମୟରେ ନ୍ୟୁରନ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ୩୭°C ଏବଂ ୫% CO2 ରେ ରଖାଗଲା ଏବଂ ସପ୍ତାହରେ ଥରେ ଖାଇବାକୁ ଦିଆଗଲା। ଇନ୍ ଭିଟ୍ରୋରେ ପୁନଃସଂଯୋଗକୁ ପ୍ରେରଣା ଦେବା ପାଇଁ, AAV9 ଭାଇରସ୍ ଭେକ୍ଟରର 3μl (୨୪-ୱେଲ୍ କଲଚର୍ ଡିସ୍) କିମ୍ବା ୦.୫μl (୨୪-ୱେଲ୍ ପ୍ଲେଟ୍) ଇନ୍ ଭିଟ୍ରୋରେ ଦ୍ୱିତୀୟ ଦିନରେ ନ୍ୟୁରନ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ଚିକିତ୍ସା ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, କ୍ୟାଟାଲଗ୍ ନମ୍ବର ୧୦୫୫୩୦-AAV9) ଏବଂ AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, କ୍ୟାଟାଲଗ୍ ନମ୍ବର ୧୦୫୫୪୫-AAV9)।
ମୂଷା Mfn1 ଏବଂ Mfn2 ପରିପୂରକ DNA (ଯଥାକ୍ରମେ Addgene plasmid #23212 ଏବଂ #23213 ରୁ ପ୍ରାପ୍ତ) C-ଟର୍ମିନସରେ V5 କ୍ରମ (GKPIPNPLLGLDST) ସହିତ ଚିହ୍ନିତ, ଏବଂ T2A କ୍ରମ ମାଧ୍ୟମରେ ଫ୍ରେମରେ mCherry ସହିତ ଫ୍ୟୁଜ କରାଯାଇଛି। Grx1-roGFP2 ହେଉଛି ହାଇଡେଲବର୍ଗ TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) ଠାରୁ ଏକ ଉପହାର। ପାରମ୍ପରିକ କ୍ଲୋନିଂ ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରି tdTomato କ୍ୟାସେଟକୁ ବଦଳାଇ, pAAV-CAG-FLEX-tdTomato ବ୍ୟାକବୋନ (Addgene ରେଫରେନ୍ସ ନମ୍ବର 28306) ରେ pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ଏବଂ pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 ଭେକ୍ଟର ସୃଷ୍ଟି କରିବା ପାଇଁ କ୍ୟାସେଟକୁ ସବ୍କ୍ଲୋନ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଭେକ୍ଟର pAAV-CAG-FLEX-mCherry ସୃଷ୍ଟି କରିବା ପାଇଁ ସମାନ ରଣନୀତି ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା। AAV-shPCx ନିର୍ମାଣ ସୃଷ୍ଟି କରିବା ପାଇଁ, ଏକ ପ୍ଲାଜମିଡ୍ AAV ଭେକ୍ଟର (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) ଆବଶ୍ୟକ, ଯେଉଁଥିରେ shRNA ଟାର୍ଗେଟିଂ ମାଉସ୍ PCx (5′CTTTCGCTTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) ଏନକୋଡିଂ କରୁଥିବା DNA କ୍ରମ ଥାଏ। U6 ପ୍ରମୋଟରଙ୍କ ନିୟନ୍ତ୍ରଣରେ, mCherry କୁ CMV ପ୍ରମୋଟରଙ୍କ ନିୟନ୍ତ୍ରଣରେ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ। ସହାୟକ AAV ଭେକ୍ଟରଗୁଡ଼ିକର ଉତ୍ପାଦନ ନିର୍ମାତାଙ୍କ ନିର୍ଦ୍ଦେଶ (ସେଲ୍ ବାୟୋଲାବ୍ସ) ଅନୁସାରେ କରାଯାଇଥିଲା। ସଂକ୍ଷେପରେ, କ୍ୟାଲସିୟମ ଫସଫେଟ୍ ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରି 293AAV କୋଷ-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) କିମ୍ବା Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) କୋଡିଂ ଜିନ୍, ଏବଂ AAV1 କ୍ୟାପସିଡ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏବଂ ଆସେସୋରି ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ୟାକେଜିଂ ପ୍ଲାଜମିଡ୍ ପ୍ଲାଜମିଡ୍ କୋଡିଂ କରି କ୍ଷଣସ୍ଥାୟୀ ଭାବରେ mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ବହନ କରୁଥିବା ଏକ ସ୍ଥାନାନ୍ତର ପ୍ଲାଜମିଡ୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ଅଶୋଧିତ ଭାଇରସ୍ ସୁପରନାଟାଣ୍ଟ ଶୁଷ୍କ ବରଫ/ଇଥାନଲ୍ ବାଥରେ ଫ୍ରିଜ୍-ଥ ଚକ୍ର ଏବଂ ଫସଫେଟ୍ ବଫର୍ ସାଲାଇନ୍ (PBS) ରେ ଲାଇଜ୍ ହୋଇଥିବା କୋଷ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇଥିଲା। AAV ଭେକ୍ଟରକୁ ବିଚ୍ଛିନ୍ନ ଆୟୋଡିକ୍ସାନୋଲ ଗ୍ରାଡିଏଣ୍ଟ ଅଲଟ୍ରାସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗେସନ୍ (32,000 rpm ଏବଂ 4°C ରେ 24 ଘଣ୍ଟା) ଦ୍ୱାରା ବିଶୋଧିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏକ Amicon ଅଲ୍ଟ୍ରା-15 ସେଣ୍ଟ୍ରାଫୁଗାଲ୍ ଫିଲ୍ଟର ବ୍ୟବହାର କରି ଘନୀଭୂତ କରାଯାଇଥିଲା। AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 ଜିନୋମ୍ କପି (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX ର ଜିନୋମ୍ ଟାଇଟର ପୂର୍ବ ବର୍ଣ୍ଣିତ (54), ପ୍ରକୃତ-ସମୟ ପରିମାଣାତ୍ମକ PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) ଏବଂ AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) ଦ୍ୱାରା ମାପ କରାଯାଇଥିଲା।
ପ୍ରାଥମିକ ନ୍ୟୁରନ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ବରଫ-ଥଣ୍ଡା 1x PBS ରେ ସ୍କ୍ରାପ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ପେଲେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା’ପରେ 0.5% ଟ୍ରାଇଟନ୍ X-100 / 0.5% ସୋଡିୟମ୍ ଡିଅକ୍ସିକୋଲେଟ୍/PBS ଲିସିସ୍ ବଫରରେ ଫସଫାଟେଜ୍ ଏବଂ ପ୍ରୋଟିଜ୍ ଇନହିବିଟର (ରୋଚେ) ସହିତ ସମନ୍ୱିତ କରାଯାଇଥିଲା। ବାଇସିଞ୍ଚୋନିନିକ୍ ଏସିଡ୍ ପରୀକ୍ଷା (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରୋଟିନ୍ ପରିମାଣୀକରଣ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରୋଟିନ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ତା’ପରେ SDS-ପଲିଆକ୍ରିଲାମାଇଡ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଦ୍ୱାରା ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା’ପରେ ଏକ ପଲିଭିନାଇଲାଇଡିନ୍ ଫ୍ଲୋରାଇଡ୍ ମେମ୍ବ୍ରାନ୍ (GE ହେଲ୍ଥକେୟାର୍) ଉପରେ ବ୍ଲଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ସ୍ଥାନଗୁଡ଼ିକୁ ଅବରୋଧ କରନ୍ତୁ ଏବଂ TBST (ଟ୍ୱିନ୍ ସହିତ ଟ୍ରାଇସ୍-ବଫର୍ଡ୍ ସାଲାଇନ୍), ଧୋଇବା ପଦକ୍ଷେପ ଏବଂ TBST ଇନକ୍ୟୁବେଟରେ ଦ୍ୱିତୀୟ ଆଣ୍ଟିବଡିରେ 5% କ୍ଷୀରରେ ପ୍ରାଥମିକ ଆଣ୍ଟିବଡି (ବିବରଣୀ ପାଇଁ ଟେବୁଲ୍ S1 ଦେଖନ୍ତୁ) ସହିତ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ। ରାତ୍ରିରେ +4°C ରେ ପ୍ରାଥମିକ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ। ଧୋଇବା ପରେ, ଦ୍ୱିତୀୟ ଆଣ୍ଟିବଡିକୁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 2 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ପ୍ରୟୋଗ କରନ୍ତୁ। ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ, ସମାନ ବ୍ଲଟ୍‌କୁ ଏକ ଆଣ୍ଟି-β-ଆକ୍ଟିନ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟ୍ କରି, ସମାନ ଲୋଡିଂ ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଥିଲା। କେମିଲୁମିନେସେନ୍ସରେ ରୂପାନ୍ତର କରି ଏବଂ କେମିଲୁମିନେସେନ୍ସ ବୃଦ୍ଧି କରି (GE ହେଲ୍ଥକେୟାର) ଚିହ୍ନଟ।
ପୂର୍ବରୁ କାଚ କଭରସ୍ଲିପ୍‌ରେ ସିଡେଡ୍ ହୋଇଥିବା ନ୍ୟୁରନ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ସମୟରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 4% ପାରାଫର୍ମାଲ୍ଡିହାଇଡ୍ (PFA)/PBS ସହିତ ସ୍ଥିର କରାଯାଇଥିଲା। କଭରସ୍ଲିପ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ପ୍ରଥମେ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 0.1% ଟ୍ରାଇଟନ୍ X-100/PBS ସହିତ ପରିପୂର୍ଣ୍ଣ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା’ପରେ ବ୍ଲକିଂ ବଫର [3% ବୋଭାଇନ୍ ସେରମ୍ ଆଲବୁମିନ୍ (BSA)/PBS] ରେ ରଖାଯାଇଥିଲା। ଦ୍ୱିତୀୟ ଦିନରେ, କଭରସ୍ଲିପ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ବ୍ଲକିଂ ବଫର ସହିତ ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଉପଯୁକ୍ତ ଫ୍ଲୋରୋଫୋର-କଞ୍ଜୁଗେଟେଡ୍ ସେକେଣ୍ଡାରୀ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ 2 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା; ଶେଷରେ, ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ 4′ ସହିତ PBS ରେ ଭଲ ଭାବରେ ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା, 6-ଡାୟାମିଡିନୋ-2 -ଫେନିଲିଣ୍ଡୋଲ୍ (DAPI) କାଉଣ୍ଟରଷ୍ଟେନ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ତା’ପରେ ଆକ୍ୱା-ପଲି/ମାଉଣ୍ଟ ସହିତ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ ସ୍ଲାଇଡ୍‌ରେ ସ୍ଥିର କରାଯାଇଥିଲା।
ମୂଷା (ପୁରୁଷ ଏବଂ ମହିଳା)ଙ୍କୁ କେଟାମାଇନ୍ (୧୩୦ ମିଗ୍ରା/କିଗ୍ରା) ଏବଂ ଜାଇଲାଜିନ୍ (୧୦ ମିଗ୍ରା/କିଗ୍ରା) ର ଇଣ୍ଟ୍ରାପେରିଟୋନିଆଲ୍ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦ୍ୱାରା ନିଶ୍ଚେତକ ଦିଆଯାଇଥିଲା ଏବଂ କାର୍ପ୍ରୋଫେନ୍ ଆନାଲଜେସିକ୍ (୫ ମିଗ୍ରା/କିଗ୍ରା) ସହିତ ଉପରମୁଣ୍ଡରେ ଦିଆ ଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ଏକ ଉଷ୍ମ ପ୍ୟାଡ୍ ସହିତ ସଜ୍ଜିତ ଏକ ଷ୍ଟେରିଓଟାକ୍ଟିକ୍ ଉପକରଣ (Kopf) ରେ ରଖାଯାଇଥିଲା। ଖପୁରୀକୁ ଖୋଲା କରନ୍ତୁ ଏବଂ ମିସ୍ ହାଡ଼ ସହିତ ସମ୍ପର୍କିତ ସେରିବେଲାର୍ କର୍ଟେକ୍ସର ଅଂଶକୁ ପତଳା କରିବା ପାଇଁ ଏକ ଡେଣ୍ଟାଲ୍ ଡ୍ରିଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ (ଲାମ୍ବଡାରୁ: ଲାଞ୍ଜ ୧.୮, ପାର୍ଶ୍ଵ ୧, ଲୋବ୍ୟୁଲ୍ସ IV ଏବଂ V ସହିତ ସମ୍ପର୍କିତ)। ତଳେ ଥିବା ଭାସ୍କୁଲେଚରକୁ ବାଧା ନ ଦେବା ପାଇଁ ଖପୁରୀରେ ଏକ ଛୋଟ ଗାତ ସାବଧାନତାର ସହିତ ସୃଷ୍ଟି କରିବା ପାଇଁ ଏକ ବକ୍ର ସିରିଞ୍ଜ୍ ଛୁଞ୍ଚି ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ତା’ପରେ ପତଳା ଟାଣିଆ କାଚ କୈଶିକାକୁ ଧୀରେ ଧୀରେ ମାଇକ୍ରୋ-ହୋଲ୍ (ଡ୍ୟୁରା ମାଟରର ଭେଣ୍ଟ୍ରାଲ୍ ପାର୍ଶ୍ଵରେ -1.3 ରୁ -1 ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ) ଭିତରକୁ ପ୍ରବେଶ କରାଯାଏ, ଏବଂ 200 ରୁ 300 nl AAV କୁ 10 ରୁ 20 ମିନିଟ୍ ସମୟ ମଧ୍ୟରେ କମ୍ ଚାପରେ ମାନୁଆଲ୍ ସିରିଞ୍ଜ (ନାରିଶିଗେ) ସାହାଯ୍ୟରେ ମାଇକ୍ରୋ-ଇଞ୍ଜେକ୍ଟର (ନାରିଶିଗେ) ରେ ଇନଜେକ୍ଟ କରାଯାଏ। ଇନଫ୍ୟୁଜନ ପରେ, ଭାଇରସକୁ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଭାବରେ ବ୍ୟାପିବା ପାଇଁ ଆଉ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ କୈଶିକାକୁ ରଖନ୍ତୁ। କୈଶିକାଗୁଡ଼ିକୁ ପ୍ରତ୍ୟାହାର କରିବା ପରେ, କ୍ଷତ ପ୍ରଦାହକୁ କମ କରିବା ଏବଂ ପଶୁକୁ ସୁସ୍ଥ ହେବା ପାଇଁ ଚର୍ମକୁ ସାବଧାନତାର ସହିତ ସିଲେଇ କରାଯାଏ। ଅସ୍ତ୍ରୋପଚାର ପରେ କିଛି ଦିନ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କୁ ଯନ୍ତ୍ରଣା ନିବାରକ (କାସ୍ପୋଫେନ୍) ସହିତ ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିଲା, ଏହି ସମୟ ମଧ୍ୟରେ ସେମାନଙ୍କର ଶାରୀରିକ ଅବସ୍ଥାକୁ ସତର୍କତାର ସହ ନିରୀକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ତା’ପରେ ସେମାନଙ୍କୁ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ସମୟରେ euthanized କରାଯାଇଥିଲା। ସମସ୍ତ ପ୍ରକ୍ରିୟା ୟୁରୋପୀୟ, ଜାତୀୟ ଏବଂ ପ୍ରତିଷ୍ଠାନଗତ ନିର୍ଦ୍ଦେଶାବଳୀ ଅନୁସାରେ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଜର୍ମାନୀର ଉତ୍ତର ରାଇନ-ୱେଷ୍ଟଫାଲିଆର ଉମୱେଲ୍ଟ ଏବଂ ଭର୍ବ୍ରାଉଚରସ୍ଚୁଟ୍ଜର ଲ୍ୟାଣ୍ଡେସାମଟ୍ଫୁର୍ନାଟୁର ଦ୍ୱାରା ଅନୁମୋଦିତ ହୋଇଥିଲା।
ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କୁ କେଟାମାଇନ୍ (100 mg/kg) ଏବଂ ଜାଇଲାଜିନ୍ (10 mg/kg) ସହିତ ନିଶ୍ଚେତକ ଦିଆଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ହୃଦୟକୁ ପ୍ରଥମେ 0.1 M PBS ସହିତ ଏବଂ ତାପରେ PBS ରେ 4% PFA ସହିତ ପର୍ଫ୍ୟୁଜ କରାଯାଇଥିଲା। ଟିସୁକୁ ବିଚ୍ଛେଦ କରି 4% PFA/PBS ରେ ରାତାରାତି 4°C ରେ ସ୍ଥିର କରାଯାଇଥିଲା। PBS ରେ ସ୍ଥିର ମସ୍ତିଷ୍କରୁ ସାଗିଟାଲ୍ ସେକ୍ସନ୍ (50 μm ଘନ) ପ୍ରସ୍ତୁତ କରିବା ପାଇଁ ଏକ କମ୍ପନଶୀଳ ଛୁରୀ (Leica Microsystems GmbH, ଭିଏନା, ଅଷ୍ଟ୍ରିଆ) ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। ଅନ୍ୟଥା ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ନ ହୋଇଥିଲେ, ଉପରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ (13) ପରି କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ମୁକ୍ତ-ଭାସମାନ ସେକ୍ସନ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ସ୍ଟେନ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଘୂର୍ଣ୍ଣନ କରାଯାଇଥିଲା। ସଂକ୍ଷେପରେ, ପ୍ରଥମେ, ପ୍ରାପ୍ତ ସ୍ଲାଇସ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 15 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 0.5% ଟ୍ରାଇଟନ୍ X-100/PBS ସହିତ ପାରମେବିଲାଇଜ୍ କରାଯାଇଥିଲା; କିଛି ଏପିଟୋପ୍ସ (Pcx ଏବଂ Shmt2) ପାଇଁ, 80°C (PH 9) ରେ tris-EDTA ବଫରରେ ଏହି ପଦକ୍ଷେପ ବଦଳରେ 25 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ସ୍ଲାଇସ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ଗରମ କରନ୍ତୁ। ଏହା ପରେ, ବିଭାଗଗୁଡ଼ିକୁ ବ୍ଲକିଂ ବଫର (3% BSA/PBS) ରେ ରାତାରାତି ଘୁଞ୍ଚାଇ 4°C ତାପମାତ୍ରାରେ ପ୍ରାଥମିକ ଆଣ୍ଟିବଡି (ସାରଣୀ S1 ଦେଖନ୍ତୁ) ସହିତ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ପରଦିନ, ବିଭାଗଗୁଡ଼ିକୁ ବ୍ଲକିଂ ବଫର ସହିତ ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଉପଯୁକ୍ତ ଫ୍ଲୋରୋଫୋର-କଞ୍ଜୁଗେଟେଡ୍ ଦ୍ୱିତୀୟ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 2 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା; ଶେଷରେ, ବିଭାଗଗୁଡ଼ିକୁ PBS ରେ ଭଲ ଭାବରେ ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା, DAPI ସହିତ ପ୍ରତି-ଦାଗ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା’ପରେ ଏକ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ ସ୍ଲାଇଡରେ ଆକ୍ୱାପଲିମାଉଣ୍ଟ ସହିତ ସ୍ଥିର କରାଯାଇଥିଲା।
ନମୁନାର ଚିତ୍ରଣ ପାଇଁ ଏକ ଲେଜର ସ୍କାନିଂ କନଫୋକାଲ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ (TCS SP8-X କିମ୍ବା TCS ଡିଜିଟାଲ୍ ଲାଇଟ୍ ସିଟ୍, Leica ମାଇକ୍ରୋସିଷ୍ଟମ୍ସ) ଏକ ଧଳା ଆଲୋକ ଲେଜର ଏବଂ ଏକ 405 ଡାୟୋଡ୍ ଅଲ୍ଟ୍ରାଭାୟୋଲେଟ୍ ଲେଜର ସହିତ ସଜ୍ଜିତ ଥିଲା। ଫ୍ଲୋରୋଫୋରକୁ ଉତ୍ତେଜିତ କରି ଏବଂ ହାଇବ୍ରିଡ୍ ଡିଟେକ୍ଟର (HyDs) ସହିତ ସିଗନାଲ ସଂଗ୍ରହ କରି, LAS-X ସଫ୍ଟୱେର୍ କ୍ରମିକ ମୋଡ୍‌ରେ Nyquist ସାମ୍ପଲିଂ ଅନୁଯାୟୀ ଷ୍ଟାକ୍ ହୋଇଥିବା ପ୍ରତିଛବି ସଂଗ୍ରହ କରିବାକୁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା: ଅଣ-ମାଣାତ୍ମକ ପ୍ୟାନେଲ୍ ପାଇଁ, ଏହା ଅତ୍ୟନ୍ତ ଗତିଶୀଳ ସିଗନାଲ (ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, ସୋମାଟିକ୍ କୋଷ ଏବଂ ଡେଣ୍ଡ୍ରାଇଟ୍ସରେ) mtYFP) BrightR ମୋଡ୍‌ରେ PN ସଂଖ୍ୟା ଚିହ୍ନଟ କରିବାକୁ HyD ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ)। ପୃଷ୍ଠଭୂମି ହ୍ରାସ କରିବା ପାଇଁ 0.3 ରୁ 6 ns ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଗେଟିଂ ପ୍ରୟୋଗ କରାଯାଏ।
ସଜାଯାଇଥିବା କୋଷଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରକୃତ-ସମୟ ଇମେଜିଂ। 1% B27 ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟ ଏବଂ 0.5 mM GlutaMax ଯୁକ୍ତ Neurobasal-A ମାଧ୍ୟମରେ ସଜାଯିବା ପରେ, କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ତୁରନ୍ତ ପଲି-l-ଲାଇସିନ୍-ଆବରଣୀୟ କାଚ ସ୍ଲାଇଡ୍ (μ-Slide8 Well, Ibidi, କ୍ୟାଟାଲଗ୍ ନମ୍ବର 80826) ରେ ସିଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା’ପରେ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ସ୍ଥିର କରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦେବା ପାଇଁ ଏହାକୁ 37°C ଏବଂ 5% CO2 ରେ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ରଖନ୍ତୁ। ଏକ ଧଳା ଲେଜର, HyD, 63×[1.4 ସଂଖ୍ୟାତ୍ମକ ଆପେର୍ଚର (NA)] ତେଲ ଅବଜେକ୍ଟିଭ୍ ଲେନ୍ସ ଏବଂ ଏକ ଗରମ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ସହିତ ସଜ୍ଜିତ ଏକ Leica SP8 ଲେଜର ସ୍କାନିଂ କନଫୋକାଲ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପରେ ରିଅଲ୍-ସମୟ ଇମେଜିଂ କରାଯାଇଥିଲା।
ମୂଷାକୁ ଶୀଘ୍ର କାର୍ବନ ଡାଇଅକ୍ସାଇଡରେ ନିଶ୍ଚେତକ ଦିଆଯାଇଥିଲା ଏବଂ ମୁଣ୍ଡ କାଟି ଦିଆଯାଇଥିଲା, ମସ୍ତିଷ୍କକୁ ଶୀଘ୍ର ଖପୁରୀରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ 200μm ଘନ (13C ଲେବଲିଂ ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ) କିମ୍ବା 275μm ଘନ (ଦୁଇଟି ଫୋଟନ୍ ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ) ସାଗିଟାଲ୍ ସେକ୍ସନରେ କାଟି ଦିଆଯାଇଥିଲା। ନିମ୍ନଲିଖିତ ସାମଗ୍ରୀରେ ପୂର୍ଣ୍ଣ ଆଇସ୍କ୍ରିମ୍ (HM-650 V, ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍, ୱାଲଡର୍ଫ, ଜର୍ମାନୀ) ନିମ୍ନଲିଖିତ ପଦାର୍ଥରେ ପୂର୍ଣ୍ଣ ହୋଇଥିଲା: 125 mM ବରଫ-ଥଣ୍ଡା, କାର୍ବନ-ସାଚୁରେଟେଡ୍ (95% O2 ଏବଂ 5% CO2) କମ୍ Ca2 + କୃତ୍ରିମ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ତରଳ (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ସୋଡିୟମ୍ ଫସଫେଟ୍ ବଫର, 25 mM NaHCO3, 25 mM ଗ୍ଲୁକୋଜ୍, 0.5 mM CaCl2 ଏବଂ 3.5 mM MgCl2 (310 ରୁ 330 mmol ର ଅସମୋଟିକ୍ ଚାପ)। ପ୍ରାପ୍ତ ମସ୍ତିଷ୍କ ସ୍ଲାଇସଗୁଡ଼ିକୁ ଅଧିକ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ସୋଡିୟମ ଫସଫେଟ୍ ବଫର, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ଗ୍ଲୁକୋଜ୍, 1.0 mM CaCl2 ଏବଂ 2.0 mM MgCl2 (ମଧ୍ୟମ) pH 7.4 ଏବଂ 310 ରୁ 320 mmol) ଧାରଣ କରିଥିବା ଏକ ପ୍ରି-ଇନ୍କ୍ୟୁବେସନ୍ ଚାମ୍ବରକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରନ୍ତୁ।
ଇମେଜିଂ ପ୍ରକ୍ରିୟା ସମୟରେ, ସ୍ଲାଇସଗୁଡ଼ିକୁ ଏକ ଉତ୍ସର୍ଗୀକୃତ ଇମେଜିଂ ରୁମକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ପରୀକ୍ଷଣଟି 32° ରୁ 33°C ସ୍ଥିର ତାପମାତ୍ରାରେ ନିରନ୍ତର ACSF ପର୍ଫ୍ୟୁଜନ୍ ଅଧୀନରେ କରାଯାଇଥିଲା। ସ୍ଲାଇସ୍ ଇମେଜିଂ ପାଇଁ ଏକ ମଲ୍ଟିଫୋଟନ୍ ଲେଜର ସ୍କାନିଂ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ (TCS SP8 MP-OPO, Leica ମାଇକ୍ରୋସିଷ୍ଟମ୍ସ) ଏକ Leica 25x ଅବଜେକ୍ଟିଭ୍ ଲେନ୍ସ (NA 0.95, ପାଣି), Ti: ନୀଳମଣି ଲେଜର (ଚୈମେଲିଅନ୍ ଭିଜନ II, କୋହେରେଣ୍ଟ) ସହିତ ସଜ୍ଜିତ ଥିଲା। FLIM ମଡ୍ୟୁଲ୍ (PicoHarp300, PicoQuant)।
Grx1-roGFP2 ର FLIM। PN ଗୁଡ଼ିକର ସାଇଟୋପ୍ଲାଜମିକ୍ ରେଡକ୍ସ ଅବସ୍ଥାରେ ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡ଼ିକୁ ସାଗିଟାଲ୍ ମସ୍ତିଷ୍କ ସ୍ଲାଇସଗୁଡ଼ିକରେ ଦୁଇ-ଫୋଟନ୍ FLIM ଦ୍ୱାରା ମାପ କରାଯାଇଥିଲା, ଯେଉଁଠାରେ Grx1-roGFP2 ବାୟୋସେନ୍ସର PN ଗୁଡ଼ିକୁ ଟାର୍ଗେଟ କରିଥିଲା। PN ସ୍ତରରେ, ଏକ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ PN (ଅର୍ଥାତ୍, ଡେଣ୍ଡ୍ରାଇଟ୍ ସହିତ ମଣିଯୁକ୍ତ ଗଠନ କିମ୍ବା ନ୍ୟୁରୋନାଲ୍ ମର୍ଫୋଲିକାଲ୍ ପରିବର୍ତ୍ତନର ଅଭାବ) ଏବଂ ଡବଲ ପଜିଟିଭ୍ roGFP2 ସେନ୍ସର ଏବଂ AAV ଏନକୋଡିଂ shRNA PCx କିମ୍ବା ଏହାର ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କ୍ରମ (ପ୍ରତ୍ୟେକ ସହ-ପ୍ରକାଶକ mCherry) ନିଶ୍ଚିତ କରିବା ପାଇଁ ସ୍ଲାଇସ୍ ପୃଷ୍ଠ ତଳେ ପ୍ରାୟ 50 ରୁ 80 μm ଅଧିଗ୍ରହଣ କ୍ଷେତ୍ର ଚୟନ କରାଯାଏ। 2x ଡିଜିଟାଲ ଜୁମ୍ ସହିତ ଏକକ-ଷ୍ଟାକ୍ ପ୍ରତିଛବି ସଂଗ୍ରହ କରନ୍ତୁ [ଉତ୍ତେଜନା ତରଙ୍ଗଦୈର୍ଘ୍ୟ: 890 nm; 512 nm 512 ପିକ୍ସେଲ୍]। ଚିହ୍ନଟ: ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ HyD, ଫ୍ଲୋରେସିନ୍ ଆଇସୋଥିଓସାଇନାଟ୍ (FITC) ଫିଲ୍ଟର ଗୋଷ୍ଠୀ] ଏବଂ 2 ରୁ 3 ମିନିଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ପ୍ରତିଛବି ହାରାହାରି ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ ଯାହା ନିଶ୍ଚିତ କରେ ଯେ କର୍ଭ ଫିଟିଂ ପାଇଁ ଯଥେଷ୍ଟ ଫୋଟନ୍ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଛି (ମୋଟରେ 1000 ଫୋଟନ୍)। Grx1-roGFP2 ପ୍ରୋବର ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ଏବଂ FLIM ଅବସ୍ଥାର ଯାଞ୍ଚ roGFP2 ର ଜୀବନକାଳ ମୂଲ୍ୟ ନିରୀକ୍ଷଣ କରି କରାଯାଇଥିଲା ଯେତେବେଳେ ପରଫ୍ୟୁଜନ ACSF ରେ ବାହ୍ୟ 10 mM H2O2 ଯୋଡିଥିଲା ​​(ଅକ୍ସିଡେସନକୁ ସର୍ବାଧିକ କରିବା ପାଇଁ, ଯାହା ଫଳରେ ଜୀବନକାଳ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଥିଲା), ଏବଂ ତାପରେ 2 mM ଡିଥିଓଥ୍ରେଇଟଲ (କ୍ଷୟ ଡିଗ୍ରୀକୁ ସର୍ବନିମ୍ନ କରେ, ଯାହା ଫଳରେ ଜୀବନକାଳ ହ୍ରାସ ପାଏ) (ଚିତ୍ର S8, D ରୁ G)। ପ୍ରାପ୍ତ ଫଳାଫଳ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବା ପାଇଁ FLIMfit 5.1.1 ସଫ୍ଟୱେର୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ, ସମଗ୍ର ପ୍ରତିଛବିର ଏକକ ଘାତାଙ୍କ କ୍ଷୟ କର୍ଭକୁ ମାପ କରାଯାଇଥିବା IRF (ଉପକରଣ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା କାର୍ଯ୍ୟ) ସହିତ ଫିଟ୍ କରନ୍ତୁ, ଏବଂ χ2 ପ୍ରାୟ 1 ଅଟେ। ଏକକ PN ର ଜୀବନକାଳ ଗଣନା କରିବା ପାଇଁ, ସ୍ନାୟୁ ଶରୀର ଚାରିପାଖରେ ମାସ୍କକୁ ମାନୁଆଲୀ ଅଙ୍କନ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ପ୍ରତ୍ୟେକ ମାସ୍କରେ ହାରାହାରି ଜୀବନକାଳ ପରିମାଣ ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା।
ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ପୋଟେନ୍ସିଆଲ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ। ତୀବ୍ର ଅଂଶକୁ 100 nM TMRM ସହିତ ସିଧାସଳଖ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ପର୍ଫ୍ୟୁଜ୍ ହୋଇଥିବା ACSF ରେ ଯୋଡାଯିବା ପରେ, PN ଗୁଡ଼ିକର ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ପୋଟେନ୍ସିଆଲ୍ ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡ଼ିକୁ ଏକ ଦୁଇ-ଫୋଟନ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ ଦ୍ୱାରା ମାପ କରାଯାଇଥିଲା। TMRM ଇମେଜିଂ 920 nm ରେ ପ୍ରୋବ୍ କୁ ଉତ୍ସାହିତ କରି ଏବଂ ସଂକେତ ସଂଗ୍ରହ କରିବା ପାଇଁ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ HyD (ଟେଟ୍ରାମେଥିଲ୍ରୋଡାମାଇନ୍ ଆଇସୋଥିଓସାଇନାଟ୍: 585/40 nm) ବ୍ୟବହାର କରି କରାଯାଇଥିଲା; ସମାନ ଉତ୍ତେଜନା ତରଙ୍ଗଦୈର୍ଘ୍ୟ ବ୍ୟବହାର କରି କିନ୍ତୁ mtYFP ପ୍ରତିଛବି କରିବା ପାଇଁ ଏକ ଭିନ୍ନ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ HyD (FITC :525/50) ବ୍ୟବହାର କରି। ଏକକ କୋଷ ସ୍ତରରେ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ପୋଟେନ୍ସିଆଲ୍ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରିବା ପାଇଁ ImageJ ର ଇମେଜ୍ କାଲକୁଲେଟର୍ ପ୍ଲଗ୍-ଇନ୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ସଂକ୍ଷେପରେ, ପ୍ଲଗ୍-ଇନ୍ ସମୀକରଣ: ସିଗନାଲ = ମିନ୍ (mtYFP, TMRM) ସମ୍ପୃକ୍ତ ଚ୍ୟାନେଲର ଏକକ-ଷ୍ଟାକ୍ କନଫୋକାଲ୍ ପ୍ରତିଛବିରେ ପୁରକିଞ୍ଜେ ସୋମାଲିରେ TMRM ସିଗନାଲ ଦେଖାଉଥିବା ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଅଞ୍ଚଳକୁ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ। ତା'ପରେ ପରିଣାମସ୍ୱରୂପ ମାସ୍କରେ ଥିବା ପିକ୍ସେଲ କ୍ଷେତ୍ରକୁ ପରିମାଣିତ କରାଯାଏ, ଏବଂ ତା'ପରେ mtYFP ଚ୍ୟାନେଲର ସମ୍ପୃକ୍ତ ସୀମା ସିଙ୍ଗଲ-ଷ୍ଟାକ୍ ପ୍ରତିଛବିରେ ସ୍ୱାଭାବିକ କରାଯାଏ ଯାହା ଦ୍ୱାରା ମାଇଟୋକୋଣ୍ଡ୍ରିଆଲ ସମ୍ଭାବନା ଦେଖାଉଥିବା ମାଇଟୋକୋଣ୍ଡ୍ରିଆଲ ଭଗ୍ନାଂଶ ପ୍ରାପ୍ତ ହୁଏ।
ହ୍ୟୁଜେନ୍ସ ପ୍ରୋ (ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍ ଭଲ୍ୟୁମ୍ ଇମେଜିଂ) ସଫ୍ଟୱେର୍ ସାହାଯ୍ୟରେ ପ୍ରତିଛବିକୁ ଡିକନ୍ଭୋଲ୍ୟୁଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ଟାଇଲ୍ସର ସ୍କାନ ହୋଇଥିବା ପ୍ରତିଛବି ପାଇଁ, LAS-X ସଫ୍ଟୱେର୍ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରଦାନ କରାଯାଇଥିବା ସ୍ୱୟଂଚାଳିତ ସିଲାଇ ଆଲଗୋରିଦମ ବ୍ୟବହାର କରି ଏକକ ଟାଇଲର ମୋଣ୍ଟେଜ୍ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇଛି। ପ୍ରତିଛବି କାଲିବ୍ରେସନ୍ ପରେ, ପ୍ରତିଛବିକୁ ଆହୁରି ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ କରିବା ଏବଂ ଉଜ୍ଜ୍ୱଳତା ଏବଂ ବିପରୀତତାକୁ ସମାନ ଭାବରେ ସଜାଡ଼ିବା ପାଇଁ ImageJ ଏବଂ Adobe Photoshop ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ଗ୍ରାଫିକ୍ ପ୍ରସ୍ତୁତି ପାଇଁ Adobe Illustrator ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ।
mtDNA ଫୋକସ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ। କନଫୋକାଲ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ ଦ୍ୱାରା DNA ବିରୁଦ୍ଧରେ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା ସେରିବେଲାର୍ ସେକ୍ସନରେ mtDNA କ୍ଷତ ସଂଖ୍ୟା ପରିମାଣ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରତ୍ୟେକ ଲକ୍ଷ୍ୟ କ୍ଷେତ୍ର କୋଷ ଶରୀର ଏବଂ ପ୍ରତ୍ୟେକ କୋଷର ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସ୍ ପାଇଁ ସୃଷ୍ଟି କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ସମ୍ପୃକ୍ତ କ୍ଷେତ୍ରକୁ ମଲ୍ଟି ମେଜର ପ୍ଲଗ୍-ଇନ୍ (ImageJ ସଫ୍ଟୱେର୍) ବ୍ୟବହାର କରି ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା। ସାଇଟୋପ୍ଲାଜମ୍ କ୍ଷେତ୍ର ପାଇବା ପାଇଁ କୋଷ ଶରୀର କ୍ଷେତ୍ରରୁ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟର୍ କ୍ଷେତ୍ର ବିଯୋଗ କରନ୍ତୁ। ଶେଷରେ, ଥ୍ରେସହୋଲ୍ଡ ପ୍ରତିଛବିରେ mtDNA ସୂଚାଉଥିବା ସାଇଟୋପ୍ଲାଜମ୍ ଡିଏନଏ ପଏଣ୍ଟଗୁଡ଼ିକୁ ସ୍ୱୟଂଚାଳିତ ଭାବରେ ପରିମାଣ କରିବା ପାଇଁ ଆନାଲାଇଜ୍ ପାର୍ଟିକ୍ଲ୍ସ ପ୍ଲଗ୍-ଇନ୍ (ImageJ ସଫ୍ଟୱେର୍) ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ପ୍ରାପ୍ତ ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକୁ CTRL ମୂଷାର PN ହାରାହାରିକୁ ସ୍ୱାଭାବିକ କରାଯାଇଥିଲା। ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକୁ ପ୍ରତି କୋଷ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସାଇଡ୍‌ର ହାରାହାରି ସଂଖ୍ୟା ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରାଯାଇଛି।
ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରକାଶନ ବିଶ୍ଳେଷଣ। ଏକକ କୋଷ ସ୍ତରରେ PN ରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରକାଶନ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରିବା ପାଇଁ ImageJ ର ଇମେଜ୍ କାଲକୁଲେଟର ପ୍ଲଗ-ଇନ୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ସଂକ୍ଷେପରେ, ସମ୍ବନ୍ଧିତ ଚ୍ୟାନେଲର ଏକକ-ସ୍ତର କନଫୋକାଲ୍ ପ୍ରତିଛବିରେ, ସମୀକରଣ ମାଧ୍ୟମରେ: ସିଗନାଲ = ସର୍ବନିମ୍ନ (mtYFP, ଆଣ୍ଟିବଡି), ପୁରକିନାରେ ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଆଣ୍ଟିବଡି ପ୍ରତି ଇମ୍ୟୁନୋରିଆକ୍ଟିଭିଟି ଦେଖାଉଥିବା ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ କ୍ଷେତ୍ରକୁ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଏ। ତା'ପରେ ପରିଣାମସ୍ୱରୂପ ମାସ୍କରେ ପିକ୍ସେଲ କ୍ଷେତ୍ରକୁ ପରିମାଣିତ କରାଯାଏ, ଏବଂ ତା'ପରେ ପ୍ରଦର୍ଶିତ ପ୍ରୋଟିନର ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଭଗ୍ନାଂଶ ପାଇବା ପାଇଁ mtYFP ଚ୍ୟାନେଲର ସମ୍ପୃକ୍ତ ଥ୍ରେସହୋଲ୍ଡ ସିଙ୍ଗଲ୍-ଷ୍ଟାକ୍ ପ୍ରତିଛବିରେ ସାଧାରଣୀକରଣ କରାଯାଏ।
ପୁରକିଞ୍ଜେ କୋଷ ଘନତା ବିଶ୍ଳେଷଣ। ଗଣନା କରାଯାଇଥିବା କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଦ୍ୱାରା ଅଧିକୃତ ସେରିବେଲାର ରିଙ୍ଗର ଲମ୍ବ ଦ୍ୱାରା ଗଣନା କରାଯାଇଥିବା ପୁରକିଞ୍ଜେ କୋଷଗୁଡ଼ିକର ସଂଖ୍ୟାକୁ ଭାଗ କରି ପୁରକିଞ୍ଜେ ଘନତା ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରିବା ପାଇଁ ImageJ ର ସେଲ୍ କାଉଣ୍ଟର ପ୍ଲଗ-ଇନ୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା।
ନମୁନା ପ୍ରସ୍ତୁତି ଏବଂ ସଂଗ୍ରହ। ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଗୋଷ୍ଠୀ ଏବଂ Mfn2cKO ମୂଷାଙ୍କ ମସ୍ତିଷ୍କକୁ 0.1 M ଫସଫେଟ୍ ବଫର (PB) ରେ 2% PFA/2.5% ଗ୍ଲୁଟାରାଲଡିହାଇଡ୍ ରେ ସ୍ଥିର କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା’ପରେ ସିଲିଏଟ୍ସ (Leica Mikrosysteme GmbH, ଭିଏନା, ଅଷ୍ଟ୍ରିଆ) (ଘନତା 50 ରୁ 60 μm) ବ୍ୟବହାର କରି କରୋନାଲ୍ ବିଭାଗ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇଥିଲା। ତା’ପରେ 1% os ଟେଟ୍ରାଅକ୍ସାଇଡ୍ ଏବଂ 1.5% ପୋଟାସିୟମ୍ ଫେରୋସାଇନାଇଡ୍ ରେ PB ବଫରରେ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ସ୍ଥିର କରାଯାଇଥିଲା। ବିଭାଗଗୁଡ଼ିକୁ ଡିଷ୍ଟିଲେଡ୍ ପାଣିରେ ତିନିଥର ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା’ପରେ 20 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 1% ୟୁରାନିଲ୍ ଆସେଟେଟ୍ ଯୁକ୍ତ 70% ଇଥାନଲ୍ ସହିତ ରଙ୍ଗ କରାଯାଇଥିଲା। ବିଭାଗଗୁଡ଼ିକୁ ତା’ପରେ ଗ୍ରେଡେଡ୍ ଆଲକୋହଲରେ ଡିହାଇଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ସିଲିକନ୍-ଆବରଣିତ ଗ୍ଲାସ୍ ସ୍ଲାଇଡ୍ ମଧ୍ୟରେ ଡର୍କୁପାନ୍ ACM (ଆରାଲଡାଇଟ୍ କାଷ୍ଟିଂ ରେଜିନ୍ M) ଇପୋକ୍ସି ରେଜିନ୍ (ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋନ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ସାଇନ୍ସ, କ୍ୟାଟାଲଗ୍ ନମ୍ବର 14040) ରେ ସ୍ଥାପିତ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ଶେଷରେ 60°C ରେ 48 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଚୁଲିରେ ପଲିମରାଇଜ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ସେରେବେଲାର କର୍ଟେକ୍ସ କ୍ଷେତ୍ରକୁ ଚୟନ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଲାଇକା ଅଲଟ୍ରାକଟ (ଲାଇକା ମାଇକ୍ରୋସିଷ୍ଟମେ GmbH, ଭିଏନା, ଅଷ୍ଟ୍ରିଆ) ରେ 50 nm ଅଲଟ୍ରାଥିନ୍ ସେକ୍ସନଗୁଡ଼ିକୁ କାଟି ପଲିଷ୍ଟାଇରିନ୍ ଫିଲ୍ମ ସହିତ ଆବୃତ 2×1 ମିମି ତମ୍ବା ସ୍ଲିଟ୍ ଗ୍ରୀଡ୍ ଉପରେ ବାଛି ଦିଆଯାଇଥିଲା। ସେକ୍ସନଗୁଡ଼ିକୁ H2O ରେ 4% ୟୁରାନିଲ୍ ଆସେଟେଟ୍ ଦ୍ରବଣ ସହିତ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ରଙ୍ଗ କରାଯାଇଥିଲା, H2O ସହିତ ଅନେକ ଥର ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା, ତାପରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ H2O ରେ ରେନୋଲ୍ଡସ୍ ଲିଡ୍ ସାଇଟ୍ରେଟ୍ ସହିତ ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତାପରେ H2O ସହିତ ଅନେକ ଥର ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା। ଏକ ଟ୍ରାନ୍ସମିସନ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋନ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ ଫିଲିପ୍ସ CM100 (ଥରମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍, ୱାଲଥାମ୍, MA, USA) ସହିତ ଏକ TVIPS (Tietz ଭିଡିଓ ଏବଂ ଇମେଜ୍ ପ୍ରୋସେସିଂ ସିଷ୍ଟମ୍) TemCam-F416 ଡିଜିଟାଲ୍ କ୍ୟାମେରା (TVIPS GmbH, Gauting, USA) ବ୍ୟବହାର କରି ମାଇକ୍ରୋଗ୍ରାଫ୍ ନିଆଯାଇଥିଲା। ଜର୍ମାନୀ)।
AAV ଦ୍ୱାରା ସଂକ୍ରମିତ ମୂଷା ପାଇଁ, ମସ୍ତିଷ୍କକୁ ପୃଥକ କରାଯାଇ 1 ମିମି ଘନ ସାଗିଟାଲ୍ ସେକ୍ସନରେ କାଟି ଦିଆଯାଇଥିଲା, ଏବଂ AAV-ସଂକ୍ରମିତ ରିଙ୍ଗ (ଅର୍ଥାତ୍ mCherry ପ୍ରକାଶନ) ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ ଏକ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ସେରିବେଲମ୍ ପରୀକ୍ଷା କରାଯାଇଥିଲା। କେବଳ ସେହି ପରୀକ୍ଷଣ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ ଯେଉଁଥିରେ AAV ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ପୁରକିଞ୍ଜେ କୋଷ ସ୍ତର (ଅର୍ଥାତ୍ ପ୍ରାୟ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ସ୍ତର) ର ଅତି କମରେ ଦୁଇଟି କ୍ରମାଗତ ସେରିବେଲାର୍ ରିଙ୍ଗରେ ଅତି ଉଚ୍ଚ ଟ୍ରାନ୍ସଡକ୍ସନ୍ ଦକ୍ଷତା ପ୍ରଦାନ କରେ। AAV-ଟ୍ରାନ୍ସଡ୍ୟୁସ୍ଡ ଲୁପ୍ ରାତାରାତି ପୋଷ୍ଟ-ଫିକ୍ସେସନ୍ (0.1 M କୋକୋଟ୍ ବଫରରେ 4% PFA ଏବଂ 2.5% ଗ୍ଲୁଟାରାଲଡିହାଇଡ୍) ପାଇଁ ମାଇକ୍ରୋଡିସେକ୍ଟ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଆହୁରି ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ କରାଯାଇଥିଲା। EPON ଏମ୍ବେଡିଂ ପାଇଁ, ସ୍ଥିର ଟିସୁକୁ 0.1 M ସୋଡିୟମ୍ କୋକୋଟ୍ ବଫର (Applichen) ରେ 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) ସହିତ 0.1 M ସୋଡିୟମ୍ କୋକୋଟ୍ ବଫର (Applichen) ରେ 4 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ତାପରେ 2 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା। 0.1 M କୋକାମାଇଡ୍ ବଫର ସହିତ 3 ଥର ପୁନରାବୃତ୍ତି କରାଯାଇଥିଲା। ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ, ଇଥାନଲର ଊର୍ଦ୍ଧ୍ୱବର୍ତ୍ତୀ ଶୃଙ୍ଖଳାକୁ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଇଥାନଲ ଦ୍ରବଣକୁ 4°C ରେ 15 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟ୍ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା ଦ୍ୱାରା ଟିସୁକୁ ଡିହାଇଡ୍ରେଟ୍ କରାଯାଇପାରିବ। ଟିସୁକୁ ପ୍ରୋପିଲିନ୍ ଅକ୍ସାଇଡ୍ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 4°C ରେ EPON (ସିଗ୍ମା-ଆଲଡ୍ରିଚ୍) ରେ ରାତାରାତି ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ଟିସୁକୁ ତାଜା EPON ରେ 2 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ରଖନ୍ତୁ, ଏବଂ ତାପରେ ଏହାକୁ 62°C ରେ 72 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଏମ୍ବେଡ୍ କରନ୍ତୁ। 70 nm ଅଲଟ୍ରାଥିନ୍ ଅଂଶ କାଟିବା ପାଇଁ ଏକ ଅଲଟ୍ରାମାଇକ୍ରୋଟୋମ୍ (ଲାଇକା ମାଇକ୍ରୋସିଷ୍ଟମ୍ସ, UC6) ଏବଂ ଏକ ହୀରା ଛୁରୀ (ଡାଏଟୋମ୍, ବିଏଲ୍, ସ୍ୱିଜରଲ୍ୟାଣ୍ଡ) ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ, ଏବଂ 37°C ରେ 15 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 1.5% ୟୁରାନିଲ୍ ଆସେଟେଟ୍ ସହିତ ରଙ୍ଗ କରନ୍ତୁ, ଏବଂ 4 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ସୀସା ସାଇଟ୍ରେଟ୍ ଦ୍ରବଣ ସହିତ ରଙ୍ଗ କରନ୍ତୁ। କ୍ୟାମେରା OneView 4K 16-ବିଟ୍ (ଗାଟାନ୍) ଏବଂ ଡିଜିଟାଲ୍‌ମାଇକ୍ରୋଗ୍ରାଫ୍ ସଫ୍ଟୱେର୍ (ଗାଟାନ୍) ସହିତ ସଜ୍ଜିତ JEM-2100 ପ୍ଲସ୍ ଟ୍ରାନ୍ସମିସନ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋନ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ (JEOL) ବ୍ୟବହାର କରି ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋନ୍ ମାଇକ୍ରୋଗ୍ରାଫ୍ ନିଆଯାଇଥିଲା। ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ, 5000× କିମ୍ବା 10,000× ଡିଜିଟାଲ୍ ଜୁମ୍ ସହିତ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋନ୍ ମାଇକ୍ରୋଗ୍ରାଫ୍ ହାସଲ କରାଯାଇଥିଲା।
ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆର ରୂପଗତ ବିଶ୍ଳେଷଣ। ସମସ୍ତ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ, ଇମେଜଜେ ସଫ୍ଟୱେର୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଡିଜିଟାଲ୍ ପ୍ରତିଛବିରେ ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆର ରୂପକୁ ମାନୁଆଲି ଭାବରେ ବର୍ଣ୍ଣନା କରାଯାଇଥିଲା। ବିଭିନ୍ନ ରୂପଗତ ପାରାମିଟରଗୁଡିକ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଛି। ପ୍ରତ୍ୟେକ କୋଷର ମୋଟ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ କ୍ଷେତ୍ରକୁ ସାଇଟୋପ୍ଲାଜମ୍ କ୍ଷେତ୍ର (ସାଇଟୋପ୍ଲାଜମ୍ କ୍ଷେତ୍ର = କୋଷ କ୍ଷେତ୍ର-କୋଷ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସ୍ କ୍ଷେତ୍ର) × 100 ଦ୍ୱାରା ବିଭାଜିତ କରି ପ୍ରାପ୍ତ ପ୍ରତିଶତ ଭାବରେ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଘନତା ପ୍ରକାଶ କରାଯାଇଛି। ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆର ଗୋଲାକାରତା ସୂତ୍ର [4π∙(କ୍ଷେତ୍ର/ପରିଧି 2)] ସହିତ ଗଣନା କରାଯାଇଛି। ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆର ଇଷ୍ଟା ରୂପଗତି ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର ମୁଖ୍ୟ ଆକୃତି ଅନୁସାରେ ଦୁଇଟି ବର୍ଗ ("ନଳୀକାର" ଏବଂ "ଫୋଡ଼ା") ରେ ବିଭକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା।
ଅଟୋଫାଗୋସୋମ/ଲାଇସୋସୋମ ସଂଖ୍ୟା ଏବଂ ଘନତା ବିଶ୍ଳେଷଣ। ଡିଜିଟାଲ୍ ପ୍ରତିଛବିରେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଅଟୋଫାଗୋସୋମ/ଲାଇସୋସୋମର ରୂପରେଖାକୁ ମାନୁଆଲୀ ରୂପରେଖା କରିବା ପାଇଁ ImageJ ସଫ୍ଟୱେର୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ପ୍ରତ୍ୟେକ କୋଷର ମୋଟ ଅଟୋଫାଗୋସୋମ/ଲାଇସୋସୋମ ଗଠନ କ୍ଷେତ୍ରକୁ ସାଇଟୋପ୍ଲାଜମ୍ କ୍ଷେତ୍ର (ସାଇଟୋପ୍ଲାଜମ୍ କ୍ଷେତ୍ର = କୋଷ କ୍ଷେତ୍ର-ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସ୍ କ୍ଷେତ୍ର) × 100 ଦ୍ୱାରା ବିଭାଜିତ କରି ଗଣନା କରାଯାଇଥିବା ଶତକଡ଼ା ଭାବରେ ଅଟୋଫାଗୋସୋମ/ଲାଇସୋସୋମର ଘନତା ଗଣନା କରାଯାଏ। ପ୍ରତି କୋଷର ଅଟୋଫାଗୋସୋମ/ଲାଇସୋସୋମ ଗଠନ ସଂଖ୍ୟା (ସାଇଟୋପ୍ଲାଜମ୍ କ୍ଷେତ୍ର ଦୃଷ୍ଟିରୁ) (ସାଇଟୋପ୍ଲାଜମ୍ କ୍ଷେତ୍ର = କୋଷ କ୍ଷେତ୍ର-ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସ୍ କ୍ଷେତ୍ର) ଦ୍ୱାରା ମୋଟ ସଂଖ୍ୟାକୁ ବିଭାଜିତ କରି ଅଟୋଫାଗୋସୋମ/ଲାଇସୋସୋମର ଘନତା ଗଣନା କରାଯାଏ।
ତୀବ୍ର ବିଭାଗୀକରଣ ଏବଂ ନମୁନା ପ୍ରସ୍ତୁତି ପାଇଁ ଲେବଲିଂ। ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଲେବଲିଂ ଆବଶ୍ୟକ କରୁଥିବା ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ, ତୀବ୍ର ମସ୍ତିଷ୍କ ସ୍ଲାଇସଗୁଡ଼ିକୁ ଏକ ପ୍ରି-ଇନ୍କ୍ୟୁବେସନ୍ ଚାମ୍ବରକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରନ୍ତୁ, ଯେଉଁଥିରେ ସାଚୁରେଟେଡ୍ କାର୍ବନ (95% O2 ଏବଂ 5% CO2), ଉଚ୍ଚ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ସୋଡିୟମ୍ ଫସଫେଟ୍ ବଫର, 25.0 mM NaHCO 3, 25.0 mM d-ଗ୍ଲୁକୋଜ୍, 1.0 mM CaCl 2 ଏବଂ 2.0 mM MgCl 2, pH 7.4 ଏବଂ 310 ରୁ 320 mOsm ସହିତ ଆଡଜଷ୍ଟ କରାଯାଇଛି), ଯେଉଁଥିରେ ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ 13 C 6- ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ (ୟୁରିସୋଟପ୍, କ୍ୟାଟାଲଗ୍ ନମ୍ବର CLM-1396) ଥାଏ। ପାଇରୁଭେଟ୍ ଲେବଲ୍ ଆବଶ୍ୟକ କରୁଥିବା ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ, ତୀବ୍ର ମସ୍ତିଷ୍କ ସ୍ଲାଇସଗୁଡ଼ିକୁ ଅଧିକ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ସୋଡିୟମ୍ ଫସଫେଟ୍ ବଫର, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ଗ୍ଲୁକୋଜ୍, 1.0 mM CaCl2) ରେ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରନ୍ତୁ ଏବଂ 2.0 mM MgCl2 ଯୋଡନ୍ତୁ, pH 7.4 ଏବଂ 310 ରୁ 320mOsm କୁ ଆଡଜଷ୍ଟ କରନ୍ତୁ, ଏବଂ 1 mM 1-[1-13C] ପାଇରୁଭେଟ୍ (Eurisotop, କ୍ୟାଟାଲଗ୍ ନମ୍ବର CLM-1082) ଯୋଡନ୍ତୁ। 37°C ରେ 90 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ବିଭାଗଗୁଡ଼ିକୁ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ। ପରୀକ୍ଷଣ ଶେଷରେ, ଅଂଶଗୁଡ଼ିକୁ ଶୀଘ୍ର 75 mM ଆମୋନିୟମ୍ କାର୍ବୋନେଟ୍ ଯୁକ୍ତ ଜଳୀୟ ଦ୍ରବଣ (pH 7.4) ସହିତ ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା’ପରେ 40:40:20 (v:v:v) ଆସେଟୋନିଟ୍ରାଇଲ୍ (ACN): ମିଥାନଲ୍: ପାଣିରେ ସମନ୍ୱିତ କରାଯାଇଥିଲା। ଅଂଶଗୁଡ଼ିକୁ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ବରଫରେ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟ୍ କରାଯିବା ପରେ, ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ 4°C ରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 21,000 ଗ୍ରାମ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ସ୍ପଷ୍ଟ ସୁପରନାଟାଣ୍ଟକୁ ଏକ SpeedVac କନସେଣ୍ଟ୍ରେଟରରେ ଶୁଖାଯାଇଥିଲା। ଫଳାଫଳରେ ଶୁଖିଲା ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ପେଲେଟ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ -80°C ରେ ସଂରକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା।
୧୩ ଟି C-ଲେବଲ୍ ଆମିନୋ ଏସିଡର ତରଳ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫି-ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି ବିଶ୍ଳେଷଣ। ତରଳ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫି-ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି (LC-MS) ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ, ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ପେଲେଟ୍ କୁ 75μl LC-MS ଗ୍ରେଡ୍ ପାଣିରେ ପୁନଃସ୍ଥାପିତ କରାଯାଇଥିଲା (ହନିୱେଲ୍)। 4°C ରେ 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 21,000 ଗ୍ରାମ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗେସନ୍ ପରେ, ସ୍ପଷ୍ଟ ସୁପରନାଟାଣ୍ଟର 20 μl ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ଫ୍ଲକ୍ସ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା, ଯେତେବେଳେ ଅବଶିଷ୍ଟ ନିଷ୍କାସନକୁ ତୁରନ୍ତ ଆନିଅନ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା (ନିମ୍ନରେ ଦେଖନ୍ତୁ)। ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ ବେଞ୍ଜୋୟଲ୍ କ୍ଲୋରାଇଡ୍ ଡେରିଭେଟାଇଜେସନ୍ ପ୍ରୋଟୋକଲ୍ (55, 56) ବ୍ୟବହାର କରି ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରଥମ ପଦକ୍ଷେପରେ, 100 mM ସୋଡିୟମ୍ କାର୍ବୋନେଟ୍ (ସିଗ୍ମା-ଆଲଡ୍ରିଚ୍) ର 10 μl ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ନିଷ୍କାସନର 20 μl ସହିତ ଯୋଡା ଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା’ପରେ 10 μl 2% ବେଞ୍ଜୋୟଲ୍ କ୍ଲୋରାଇଡ୍ (ସିଗ୍ମା-ଆଲଡ୍ରିଚ୍) LC ଗ୍ରେଡ୍ ACN ରେ ଯୋଡା ଯାଇଥିଲା। ନମୁନାକୁ ସଂକ୍ଷିପ୍ତ ଭାବରେ ଘୂର୍ଣ୍ଣନ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ତା’ପରେ 20°C ତାପମାତ୍ରାରେ 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 21,000 ଗ୍ରାମ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା। କ୍ଲିଅର୍ ହୋଇଥିବା ସୁପରନାଟାଣ୍ଟକୁ ଏକ କୋନିକାଲ୍ ଗ୍ଲାସ୍ ଇନସର୍ଟ (200 μl ଭଲ୍ୟୁମ୍) ସହିତ 2 ମିଲି ଅଟୋସାମ୍ପଲର ଭାଏଲ୍‌କୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ କରାଯାଇଥିଲା। Q-Exactive (QE)-HF (ଅଲ୍ଟ୍ରା ହାଇ ଫିଲ୍ଡ ଅର୍ବିଟ୍ରାପ୍) ଉଚ୍ଚ-ରିଜୋଲ୍ୟୁସନ୍ ପ୍ରିସିସନ୍ ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟର୍ (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ Acquity iClass ଅଲ୍ଟ୍ରା-ହାଇ ପରଫର୍ମାନ୍ସ LC ସିଷ୍ଟମ୍ (ୱାଟର୍) ବ୍ୟବହାର କରି ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ, ଡେରିଭେଟାଇଜ୍ଡ ନମୁନାର 2μl 1.8μm କଣିକା ଧାରଣ କରିଥିବା 100×1.0 mm ଉଚ୍ଚ-ଶକ୍ତି ସିଲିକା T3 ସ୍ତମ୍ଭ (ୱାଟର୍) ରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ଟ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରବାହ ହାର 100μl/ମିନିଟ୍, ଏବଂ ବଫର ସିଷ୍ଟମରେ ବଫର A (10 mM ଆମୋନିୟମ୍ ଫର୍ମେଟ୍ ଏବଂ ପାଣିରେ 0.15% ଫର୍ମିକ ଏସିଡ୍) ଏବଂ ବଫର B (ACN) ଥାଏ। ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ ନିମ୍ନଲିଖିତ ଭାବରେ ଅଟେ: 0 ମିନିଟରେ 0%B; 0%B। ୦ ରୁ ୦.୧ ମିନିଟରେ ୦ ରୁ ୧୫% B; ୦.୧ ରୁ ୦.୫ ମିନିଟରେ ୧୫ ରୁ ୧୭% B; ୦.୫ ରୁ ୧୪ ମିନିଟରେ ୧୭ ରୁ ୫୫% B; ୧୪ ରୁ ୧୪.୫ ମିନିଟରେ ୫୫ ରୁ ୭୦% B; ୧୮ ମିନିଟରେ ୧୪.୫ ରୁ ୭୦ ରୁ ୧୦୦% B; ୧୮ ରୁ ୧୯ ମିନିଟରେ ୧୦୦% B; ୧୯ ରୁ ୧୯.୧ ମିନିଟରେ ୧୦୦ ରୁ ୦% B; ୧୯.୧ ରୁ ୨୮ ମିନିଟରେ ୦% B (୫୫, ୫୬)। QE-HF ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟର୍ 50 ରୁ 750 ର m/z (ମାସ୍/ଚାର୍ଜ ଅନୁପାତ) ପରିସର ସହିତ ସକାରାତ୍ମକ ଆୟନାଇଜେସନ୍ ମୋଡ୍ ରେ କାର୍ଯ୍ୟ କରେ। ପ୍ରୟୋଗିତ ରିଜୋଲ୍ୟୁସନ୍ 60,000, ଏବଂ ପ୍ରାପ୍ତ ଲାଭ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ (AGC) ଆୟନ୍ ଲକ୍ଷ୍ୟ 3×106, ଏବଂ ସର୍ବାଧିକ ଆୟନ୍ ସମୟ 100 ମିଲିସେକେଣ୍ଡ। ଉତ୍ତପ୍ତ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋସ୍ପ୍ରେ ଆୟନାଇଜେସନ୍ (ESI) ଉତ୍ସ 3.5 kV ସ୍ପ୍ରେ ଭୋଲଟେଜ, 250°C ର କୈଶିକ ତାପମାତ୍ରା, 60 AU (ଆବାଧିନ ୟୁନିଟ୍) ର ଏକ ସିଥ୍ ଏୟାରଫ୍ଲୋ ଏବଂ 20 AU. 250°C ର ଏକ ସହାୟକ ଏୟାରଫ୍ଲୋରେ କାର୍ଯ୍ୟ କରେ। S ଲେନ୍ସ 60 AU ରେ ସେଟ୍ ହୋଇଛି।
୧୩ସି ଲେବଲ୍ ଜୈବିକ ଏସିଡର ଆନିଅନ୍ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫି-ଏମଏସ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ। ଏକ QE-HF ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟର୍ (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ ଏକ ଡାୟୋନେକ୍ସ ଆୟନ୍ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫି ସିଷ୍ଟମ୍ (ICS 5000+, ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ବ୍ୟବହାର କରି ଅବଶିଷ୍ଟ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ଅବଶେଷଣ (55μl) ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ସଂକ୍ଷେପରେ, 5μl ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ନିର୍ଗମକୁ HPLC (2 mm×250 mm, କଣିକା ଆକାର 4μm, ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ସହିତ ସଜ୍ଜିତ ଏକ ଡାୟୋନେକ୍ସ ଆୟନପାକ୍ AS11-HC ସ୍ତମ୍ଭରେ ପୁସ୍-ଇନ୍ ଆଂଶିକ ଲୁପ୍ ମୋଡ୍ ରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ଟ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହାର ପୂରଣ ଅନୁପାତ ୧। ) ଡାୟୋନେକ୍ସ ଆୟନପାକ୍ AG11-HC ଗାର୍ଡ ସ୍ତମ୍ଭ (2 mm x 50 mm, 4μm, ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍)। ସ୍ତମ୍ଭର ତାପମାତ୍ରା 30°C ରେ ରଖାଯାଏ, ଏବଂ ଅଟୋସାମ୍ପଲର 6°C ରେ ସେଟ୍ କରାଯାଏ। ଏଲୁଏଣ୍ଟ ଜେନେରେଟର୍ ମାଧ୍ୟମରେ ପୋଟାସିୟମ୍ ହାଇଡ୍ରୋକ୍ସାଇଡ୍ ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ ସୃଷ୍ଟି କରିବା ପାଇଁ ଡିଓନାଇଜଡ୍ ପାଣି ସହିତ ପ୍ରଦାନ କରାଯାଇଥିବା ଏକ ପୋଟାସିୟମ୍ ହାଇଡ୍ରୋକ୍ସାଇଡ୍ କାର୍ଟ୍ରିଜ୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। 380μl/ମିନିଟ୍ ପ୍ରବାହ ହାରରେ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ସକୁ ପୃଥକୀକରଣ, ନିମ୍ନଲିଖିତ ଗ୍ରାଡିଏଣ୍ଟ ପ୍ରୟୋଗ କରି: 0 ରୁ 3 ମିନିଟ୍, 10 mM KOH; 3 ରୁ 12 ମିନିଟ୍, 10 ରୁ 50 mM KOH; 12 ରୁ 19 ମିନିଟ୍, 50 ରୁ 100 mM KOH; 19 ରୁ 21 ମିନିଟ୍, 100 mM KOH; 21 ରୁ 21.5 ମିନିଟ୍, 100 ରୁ 10 mM KOH। ସ୍ତମ୍ଭକୁ 8.5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 10 mM KOH ତଳେ ପୁନଃସନ୍ତୁଳନ କରାଯାଇଥିଲା।
ସ୍ତମ୍ଭ ପରେ ଏଲୁଟେଡ୍ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ସକୁ 150μl/ମିନିଟ୍ ଆଇସୋପ୍ରୋପାନୋଲ୍ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟ ଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ସହିତ ମିଶ୍ରିତ କରାଯାଏ ଏବଂ ତା’ପରେ ନକାରାତ୍ମକ ଆୟନାଇଜେସନ୍ ମୋଡ୍‌ରେ କାର୍ଯ୍ୟ କରୁଥିବା ଏକ ଉଚ୍ଚ-ରିଜୋଲ୍ୟୁସନ୍ ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟରକୁ ନିର୍ଦ୍ଦେଶିତ କରାଯାଏ। MS 60,000 ରିଜୋଲ୍ୟୁସନ୍ ସହିତ m/z 50 ରୁ 750 ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ମାସ୍ ପରିସରକୁ ନିରୀକ୍ଷଣ କରୁଛି। AGC 1×106 ରେ ସେଟ୍ କରାଯାଇଛି, ଏବଂ ସର୍ବାଧିକ ଆୟନ୍ ସମୟ 100 ms ରେ ରଖାଯାଇଛି। ଉତ୍ତପ୍ତ ESI ଉତ୍ସକୁ 3.5 kV ର ସ୍ପ୍ରେ ଭୋଲଟେଜରେ ପରିଚାଳିତ କରାଯାଇଥିଲା। ଆୟନ୍ ଉତ୍ସର ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ସେଟିଂଗୁଡ଼ିକ ନିମ୍ନଲିଖିତ: କୈଶିକ ତାପମାତ୍ରା 275°C; ଶୀଥ୍ ଗ୍ୟାସ୍ ପ୍ରବାହ, 60 AU; ସହାୟକ ଗ୍ୟାସ୍ ପ୍ରବାହ, 300°C ରେ 20 AU, ଏବଂ S ଲେନ୍ସ 60 AU ରେ ସେଟିଂ।
୧୩ସି ଲେବଲ୍ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ସର ତଥ୍ୟ ବିଶ୍ଳେଷଣ। ଆଇସୋଟୋପ୍ ଅନୁପାତର ତଥ୍ୟ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ଟ୍ରେସଫାଇଣ୍ଡର୍ ସଫ୍ଟୱେର୍ (ସଂସ୍କରଣ ୪.୨, ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ପ୍ରତ୍ୟେକ ଯୌଗିକର ପରିଚୟ ଏକ ନିର୍ଭରଯୋଗ୍ୟ ସନ୍ଦର୍ଭ ଯୌଗିକ ଦ୍ୱାରା ଯାଞ୍ଚ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ସ୍ୱାଧୀନ ଭାବରେ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ଆଇସୋଟୋପ୍ ସମୃଦ୍ଧି ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବା ପାଇଁ, ପ୍ରତ୍ୟେକ ୧୩ସି ଆଇସୋଟୋପ୍ (Mn) ର ନିଷ୍କାସିତ ଆୟନ୍ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାମ (XIC) ର କ୍ଷେତ୍ରଫଳ [M + H] + ରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିଲା, ଯେଉଁଠାରେ n ହେଉଛି ଲକ୍ଷ୍ୟ ଯୌଗିକର କାର୍ବନ ସଂଖ୍ୟା, ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବାକୁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ କିମ୍ବା [MH] + ଆନାୟନ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବାକୁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ। XIC ର ବହନ ସଠିକତା ପ୍ରତି ନିୟୁତରେ ପାଞ୍ଚ ଅଂଶରୁ କମ୍, ଏବଂ RT ର ସଠିକତା ୦.୦୫ ମିନିଟ୍। ପ୍ରତ୍ୟେକ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ଆଇସୋଟୋପ୍ ର ଅନୁପାତକୁ ସମ୍ପୃକ୍ତ ଯୌଗିକର ସମସ୍ତ ଆଇସୋଟୋପ୍ ର ଯୋଗଫଳ ସହିତ ଗଣନା କରି ସମୃଦ୍ଧି ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଏ। ଏହି ଅନୁପାତଗୁଡ଼ିକୁ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଆଇସୋଟୋପ୍ ପାଇଁ ଶତକଡା ମୂଲ୍ୟ ଭାବରେ ଦିଆଯାଇଛି, ଏବଂ ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକୁ ମୋଲାର୍ ଶତକଡା ସମୃଦ୍ଧି (MPE) ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରାଯାଇଛି, ଯେପରି ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣନା କରାଯାଇଛି (୪୨)।
ଫ୍ରିଜଡ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ ପେଲେଟ୍‌କୁ ବରଫ-ଥଣ୍ଡା 80% ମିଥାନଲ୍ (v/v) ରେ ସମଜାତ କରାଯାଇଥିଲା, ଘୂର୍ଣ୍ଣିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ -20°C ରେ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ନମୁନାକୁ ପୁଣି ଘୂର୍ଣ୍ଣନ କରନ୍ତୁ ଏବଂ +4°C ରେ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଘୂର୍ଣ୍ଣନ କରନ୍ତୁ। ନମୁନାକୁ 4°C ରେ 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 21,000 ଗ୍ରାମ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା’ପରେ ପରବର୍ତ୍ତୀ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ 25°C ରେ SpeedVac କନସେଣ୍ଟ୍ରେଟର୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଫଳସ୍ୱରୂପ ସୁପରନାଟାଣ୍ଟ ସଂଗ୍ରହ ଏବଂ ଶୁଖାଯାଇଥିଲା। ଉପରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ପରି, ସଜାଯାଇଥିବା କୋଷଗୁଡ଼ିକର ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ଉପରେ LC-MS ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। TraceFinder (ସଂସ୍କରଣ 4.2, Thermo Fisher Scientific) ବ୍ୟବହାର କରି, ପ୍ରତ୍ୟେକ ଯୌଗିକର monoisotopic mass ବ୍ୟବହାର କରି ତଥ୍ୟ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। preprocessCore ସଫ୍ଟୱେର୍ ପ୍ୟାକେଜ୍ (57) ବ୍ୟବହାର କରି ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ତଥ୍ୟର ପରିମାଣିକ ସାଧାରଣୀକରଣ କରାଯାଇଥିଲା।
କଟା ପ୍ରସ୍ତୁତି। ମୂଷାକୁ କାର୍ବନ ଡାଇଅକ୍ସାଇଡ ସହିତ ଶୀଘ୍ର ନିଶ୍ଚେତକ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ମୁଣ୍ଡ କାଟି ଦିଆଯାଇଥିଲା, ମସ୍ତିଷ୍କକୁ ଶୀଘ୍ର ଖପୁରୀରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ବରଫ ଭର୍ତ୍ତି କମ୍ପନକାରୀ ଛୁରୀ (HM-650 V, ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍, ୱାଲଡର୍ଫ, ଜର୍ମାନୀ) ବ୍ୟବହାର କରି ଏହାକୁ 300 ରୁ 375 μm ସାଗିଟାଲ୍ ସେକ୍ସନରେ କାଟି ଦିଆଯାଇଥିଲା। ଥଣ୍ଡା କାର୍ବନ ଗ୍ୟାସିଫିକେସନ୍ (95% O2 ଏବଂ 5% CO2) ନିମ୍ନ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ସୋଡିୟମ୍ ଫସଫେଟ୍ ବଫର, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ଗ୍ଲୁକୋଜ୍, 1.0 mM CaCl2 ଏବଂ 6.0 mM MgCl2 pH 7.4 ଏବଂ 310 ରୁ 330 mOsm ସହିତ ଆଡଜଷ୍ଟ କରନ୍ତୁ। ପ୍ରାପ୍ତ ମସ୍ତିଷ୍କ ସ୍ଲାଇସଗୁଡ଼ିକୁ ଅଧିକ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ସୋଡିୟମ ଫସଫେଟ୍ ବଫର, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ଗ୍ଲୁକୋଜ୍, 4.0 mM CaCl2 ଏବଂ mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 ଏବଂ 310 ରୁ 320 mOsm ଧାରଣ କରିଥିବା ଏକ ଚାମ୍ବରକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରନ୍ତୁ। ସ୍ଲାଇସଗୁଡ଼ିକୁ 20 ରୁ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ସଂରକ୍ଷଣ କରନ୍ତୁ ଯାହା ଦ୍ଵାରା ରେକର୍ଡିଂ ପୂର୍ବରୁ ସେଗୁଡ଼ିକୁ ପୁନରୁଦ୍ଧାର କରାଯାଇପାରିବ।
ରେକର୍ଡିଂ। ସମସ୍ତ ରେକର୍ଡିଂ ପାଇଁ ଏକ ସ୍ଥିର ରେକର୍ଡିଂ ଚାମ୍ବର ଏବଂ ଏକ 20x ଜଳ ନିମଜ୍ଜନ ଅବଜେକ୍ଟିଭ୍ ଲେନ୍ସ (Scientifica) ସହିତ ସଜ୍ଜିତ ଏକ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ ଷ୍ଟେଜ୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। ପୁଟେଟିଭ୍ ପୁରକିଞ୍ଜେ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ (i) ଶରୀର ଆକାର, (ii) ସେରେବେଲମର ଆନାଟୋମିକ୍ ସ୍ଥାନ ଏବଂ (iii) ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ mtYFP ରିପୋର୍ଟର ଜିନ୍ ର ପ୍ରକାଶନ ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା। 5 ରୁ 11 ମେଗୋହମ୍ସର ଟିପ୍ ପ୍ରତିରୋଧ ସହିତ ପ୍ୟାଚ୍ ପିପେଟ୍ ଏକ ବୋରୋସିଲିକେଟ୍ ଗ୍ଲାସ୍ କ୍ୟାପିଲାରି (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, ସାଇନ୍ସ ପ୍ରଡକ୍ଟସ୍, ହୋଫେମ୍, ଜର୍ମାନୀ) ଏବଂ ଏକ ଭୂସମାନ୍ତର ପିପେଟ୍ ଉପକରଣ (P-1000, ସଟର), ନୋଭାଟୋ, CA) ଦ୍ୱାରା ବାହାର କରାଯାଇଛି। ସମସ୍ତ ରେକର୍ଡିଂଗୁଡ଼ିକ ELC-03XS npi ପ୍ୟାଚ୍ କ୍ଲାମ୍ପ ଆମ୍ପ୍ଲିଫାୟର (npi ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋନିକ୍ GmbH, ଟାମ୍, ଜର୍ମାନୀ) ଦ୍ୱାରା କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା ସଫ୍ଟୱେର୍ ସିଗନାଲ (ସଂସ୍କରଣ 6.0, କେମ୍ବ୍ରିଜ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋନିକ୍, କେମ୍ବ୍ରିଜ୍, ୟୁକେ) ଦ୍ୱାରା ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ହୋଇଥିଲା। ପରୀକ୍ଷଣଟି 12.5 kHz ନମୁନା ହାରରେ ରେକର୍ଡ କରାଯାଇଥିଲା। ସିଗନାଲକୁ ଦୁଇଟି ସର୍ଟ-ପାସ୍ ବେସେଲ୍ ଫିଲ୍ଟର ସହିତ ଫିଲ୍ଟର କରାଯାଇଛି ଯାହାର କଟଅଫ୍ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ଯଥାକ୍ରମେ 1.3 ଏବଂ 10 kHz ଅଟେ। ମେମ୍ବ୍ରାନ୍ ଏବଂ ପିପେଟର କ୍ୟାପାସିଟାନ୍ସ ଆମ୍ପ୍ଲିଫାୟର ବ୍ୟବହାର କରି କ୍ଷତିପୂରଣ ସର୍କିଟ୍ ଦ୍ୱାରା କ୍ଷତିପୂରଣ କରାଯାଏ। ସମସ୍ତ ପରୀକ୍ଷଣ ଏକ ଓର୍କା-ଫ୍ଲାସ୍ 4.0 କ୍ୟାମେରା (ହାମାମାତ୍ସୁ, ଗର୍ଡେନ, ଜର୍ମାନୀ) ନିୟନ୍ତ୍ରଣରେ କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା ହୋକାଓ ସଫ୍ଟୱେର୍ (ସଂସ୍କରଣ 2.8, ହମାମାତ୍ସୁ, ଗର୍ଡେନ, ଜର୍ମାନୀ) ଦ୍ୱାରା ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ହୋଇଥିଲା।
ନିୟମିତ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ କୋଷ ବିନ୍ୟାସ ଏବଂ ବିଶ୍ଳେଷଣ। ରେକର୍ଡିଂ ପୂର୍ବରୁ, ନିମ୍ନଲିଖିତ ପଦାର୍ଥ ଥିବା ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ଦ୍ରବଣ ସହିତ ପିପେଟ୍ ପୂରଣ କରନ୍ତୁ: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM ପୋଟାସିୟମ୍ ଗ୍ଲୁକୋନେଟ୍, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM ଗୁଆନୋସାଇନ୍ ଟ୍ରାଇଫସଫେଟ୍ (GTP) (Na) ଏବଂ 10.0 mM କ୍ରିଏଟିନିନ୍ ଫସଫେଟ୍ pH 7.25 ରେ ସଜାଡ଼ି ଦିଆଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ଅସମୋଟିକ୍ ଚାପ 290 mOsm (ସୁକ୍ରୋଜ୍) ଥିଲା। ଝିଲ୍ଲୀ ଫାଟିବା ପାଇଁ 0 pA ବଳ ପ୍ରୟୋଗ କରିବା ପରେ ତୁରନ୍ତ, ବିଶ୍ରାମ ଝିଲ୍ଲୀ ବିଭେଦକ ମାପ କରାଯାଇଥିଲା। -40, -30, -20, ଏବଂ -10 pA ର ହାଇପରପୋଲାରାଇଜଡ୍ କରେଣ୍ଟ ପ୍ରୟୋଗ କରି ଇନପୁଟ୍ ପ୍ରତିରୋଧ ମାପ କରାଯାଏ। ଭୋଲଟେଜ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାର ପରିମାଣ ମାପ କରନ୍ତୁ ଏବଂ ଇନପୁଟ୍ ପ୍ରତିରୋଧ ଗଣନା କରିବା ପାଇଁ ଓହମ୍‌ର ନିୟମ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ଏକ ଭୋଲଟେଜ କ୍ଲାମ୍ପରେ 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ସ୍ୱତଃସ୍ଫୂର୍ତ୍ତ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ରେକର୍ଡ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ sPSC କୁ Igor Pro (ସଂସ୍କରଣ 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) ରେ ଏକ ଅର୍ଦ୍ଧ-ସ୍ୱୟଂଚାଳିତ ଚିହ୍ନଟ ସ୍କ୍ରିପ୍ଟ ବ୍ୟବହାର କରି ଚିହ୍ନଟ ଏବଂ ମାପ କରାଯାଇଥିଲା। IV କର୍ଭ ଏବଂ ସ୍ଥିର-ଅବସ୍ଥା କରେଣ୍ଟ ବ୍ୟାଟେରୀକୁ ବିଭିନ୍ନ ପୋଟେନସିଆଲରେ କ୍ଲାମ୍ପ କରି (-110 mV ରୁ ଆରମ୍ଭ କରି) ଏବଂ 5 mV ପଦକ୍ଷେପରେ ଭୋଲଟେଜ ବୃଦ୍ଧି କରି ମାପ କରାଯାଇଥିଲା। ଏକ ଡିପୋଲାରାଇଜିଂ କରେଣ୍ଟ ପ୍ରୟୋଗ କରି AP ର ଉତ୍ପାଦନ ପରୀକ୍ଷା କରାଯାଇଥିଲା। ଡିପୋଲାରାଇଜିଂ କରେଣ୍ଟ ପଲ୍ସ ପ୍ରୟୋଗ କରିବା ସମୟରେ -70 mV ରେ ସେଲ୍ କ୍ଲାମ୍ପ କରନ୍ତୁ। ପ୍ରତ୍ୟେକ ରେକର୍ଡିଂ ୟୁନିଟର ଷ୍ଟେପ୍ ଆକାରକୁ ପୃଥକ ଭାବରେ (10 ରୁ 60 pA) ଆଡଜଷ୍ଟ କରନ୍ତୁ। ସର୍ବାଧିକ AP ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ସୃଷ୍ଟି କରୁଥିବା ପଲ୍ସ ସ୍ପାଇକଗୁଡ଼ିକୁ ମାନୁଆଲୀ ଗଣନା କରି ସର୍ବାଧିକ AP ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ଗଣନା କରନ୍ତୁ। AP ଥ୍ରେସହୋଲ୍ଡ ଡିପୋଲାରାଇଜିଂ ପଲ୍ସର ଦ୍ୱିତୀୟ ଡେରିଭେଟିଭ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଏ ଯାହା ପ୍ରଥମେ ଗୋଟିଏ କିମ୍ବା ଅଧିକ AP ଗୁଡ଼ିକୁ ଟ୍ରିଗର କରେ।
ଛିଦ୍ରିତ ପ୍ୟାଚ୍ ବିନ୍ୟାସ ଏବଂ ବିଶ୍ଳେଷଣ। ମାନକ ପ୍ରୋଟୋକଲ ବ୍ୟବହାର କରି ଛିଦ୍ରିତ ପ୍ୟାଚ୍ ରେକର୍ଡିଂ କରନ୍ତୁ। ଏକ ATP- ଏବଂ GTP-ମୁକ୍ତ ପାଇପେଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ ଯେଉଁଥିରେ ନିମ୍ନଲିଖିତ ଉପାଦାନ ନାହିଁ: 128 mM ଗ୍ଲୁକୋନେଟ୍ K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA ଏବଂ 2 mM MgCl2, ଏବଂ pH 7.2 (KOH ବ୍ୟବହାର କରି) ସହିତ ଆଡଜଷ୍ଟ କରନ୍ତୁ। କୋଷ ପରଦାରେ ଅନିୟନ୍ତ୍ରିତ ପାରଗମ୍ୟତାକୁ ରୋକିବା ପାଇଁ ATP ଏବଂ GTP କୁ କୋଷକୋଷୀୟ ଦ୍ରବଣରୁ ବାଦ ଦିଆଯାଇଛି। ଏକ ପଞ୍ଚଡ୍ ପ୍ୟାଚ୍ ରେକର୍ଡ ପାଇବା ପାଇଁ ପ୍ୟାଚ୍ ପିପେଟ୍ ଏକ ଆମ୍ଫୋଟେରିସିନ୍ ଯୁକ୍ତ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ଦ୍ରବଣ (ପ୍ରାୟ 200 ରୁ 250μg/ml; G4888, ସିଗମା-ଆଲଡ୍ରିଚ୍) ସହିତ ପୂର୍ଣ୍ଣ ହୋଇଛି। ଆମ୍ଫୋଟେରିସିନ୍ ଡାଇମିଥାଇଲ୍ ସଲଫକ୍ସାଇଡ୍ ରେ ଦ୍ରବୀଭୂତ ହୋଇଥିଲା (ଚୂଡ଼ାନ୍ତ ସାନ୍ଦ୍ରତା: 0.1 ରୁ 0.3%; DMSO; D8418, ସିଗମା-ଆଲଡ୍ରିଚ୍)। ବ୍ୟବହୃତ DMSO ର ସାନ୍ଦ୍ରତା ଅଧ୍ୟୟନ କରାଯାଇଥିବା ନ୍ୟୁରନ୍ ଉପରେ କୌଣସି ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପ୍ରଭାବ ପକାଇ ନଥିଲା। ପଞ୍ଚିଂ ପ୍ରକ୍ରିୟା ସମୟରେ, ଚ୍ୟାନେଲ ପ୍ରତିରୋଧ (Ra) ନିରନ୍ତର ନିରୀକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ Ra ଏବଂ AP ର ଆମ୍ପ୍ଲିଚ୍ୟୁଡ୍ ସ୍ଥିର ହେବା ପରେ (20-40 ମିନିଟ୍) ପରୀକ୍ଷଣ ଆରମ୍ଭ କରାଯାଇଥିଲା। ସ୍ୱତଃସ୍ଫୂର୍ତ୍ତ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ 2 ରୁ 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଏକ ଭୋଲଟେଜ୍ ଏବଂ/କିମ୍ବା କରେଣ୍ଟ କ୍ଲାମ୍ପରେ ମାପ କରାଯାଇଥିଲା। Igor Pro (ସଂସ୍କରଣ 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (ସଂସ୍କରଣ 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) ଏବଂ GraphPad Prism (ସଂସ୍କରଣ 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) ବ୍ୟବହାର କରି ଡାଟା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ସ୍ୱତଃସ୍ଫୂର୍ତ୍ତ AP ଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ, IgorPro ର NeuroMatic v3.0c ପ୍ଲଗ-ଇନ୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ। ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଥ୍ରେସହୋଲ୍ଡ ବ୍ୟବହାର କରି AP ଗୁଡ଼ିକୁ ସ୍ୱୟଂଚାଳିତ ଭାବରେ ଚିହ୍ନଟ କରନ୍ତୁ, ଯାହା ପ୍ରତ୍ୟେକ ରେକର୍ଡ ପାଇଁ ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ଭାବରେ ଆଡଜଷ୍ଟ କରାଯାଏ। ସ୍ପାଇକ୍ ବ୍ୟବଧାନ ବ୍ୟବହାର କରି, ସର୍ବାଧିକ ତାତ୍କାଳିକ ସ୍ପାଇକ୍ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ଏବଂ ହାରାହାରି ସ୍ପାଇକ୍ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ସହିତ ସ୍ପାଇକ୍ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରନ୍ତୁ।
PN ବିଚ୍ଛିନ୍ନତା। ପୂର୍ବରୁ ପ୍ରକାଶିତ ପ୍ରୋଟୋକଲ ସହିତ ଖାପ ଖୁଆଇ, PNଗୁଡ଼ିକୁ ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ମୂଷା ସେରିବେଲମ୍ ରୁ ଶୁଦ୍ଧ କରାଯାଇଥିଲା (58)। ସଂକ୍ଷେପରେ, ସେରିବେଲମ୍‌କୁ ଖଣ୍ଡ ଖଣ୍ଡ କରି ବରଫ-ଥଣ୍ଡା ବିଚ୍ଛିନ୍ନକରଣ ମାଧ୍ୟମରେ [HBSS Ca2+ ଏବଂ Mg2+ ବିନା, 20 mM ଗ୍ଲୁକୋଜ୍, ପେନିସିଲିନ୍ (50 U/ml) ଏବଂ ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟୋମାଇସିନ୍ (0.05 mg/ml) ସହିତ ପରିପୂରକ] କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା’ପରେ ପାପେନ୍‌ରେ ମଧ୍ୟମକୁ ହଜମ କରାଯାଇଥିଲା [HBSS, 1-ସିଷ୍ଟାଇନ୍·HCl (1 mg/ml), ପାପେନ୍ (16 U/ml) ଏବଂ ଡିଅକ୍ସିରାଇବୋନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍ I (DNase I; 0.1 mg/ml) ସହିତ ପରିପୂରକ] 30°C ତାପମାତ୍ରାରେ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଚିକିତ୍ସା କରନ୍ତୁ। ପ୍ରଥମେ ଏଞ୍ଜାଇମାଟିକ୍ ପାଚନକୁ ରୋକିବା ପାଇଁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ଅଣ୍ଡା ମ୍ୟୁକସ୍ (୧୦ ମିଗ୍ରା/ମିଲି), BSA (୧୦ ମିଗ୍ରା/ମିଲି) ଏବଂ DNase (୦.୧ ମିଗ୍ରା/ମିଲି) ଧାରଣ କରିଥିବା HBSS ମାଧ୍ୟମରେ ଟିସୁଗୁଡ଼ିକୁ ଧୋଇ ଦିଅନ୍ତୁ, ଏବଂ ତା’ପରେ ୨୦ ମିମି ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା HBSS ମାଧ୍ୟମରେ ଧୀରେ ଧୀରେ HBSS ରେ ପେନିସିଲିନ୍ (୫୦ ୟୁ/ମିଲି), ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟୋମାଇସିନ୍ (୦.୦୫ ମିଗ୍ରା/ମିଲି) ଏବଂ DNase (୦.୧ ମିଗ୍ରା/ମିଲି) ଏକକ କୋଷ ମୁକ୍ତ କରନ୍ତୁ। ଫଳସ୍ୱରୂପ କୋଷ ସସପେନସନକୁ ୭୦μm କୋଷ ଷ୍ଟ୍ରେନର୍ ମାଧ୍ୟମରେ ଫିଲ୍ଟର କରାଯାଇଥିଲା, ତା’ପରେ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗେସନ୍ (୧୧୧୦ rpm, ୫ ମିନିଟ୍, ୪°C) ଦ୍ୱାରା ପେଲେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ସର୍ଟିଙ୍ଗ୍ ମାଧ୍ୟମରେ ପୁନଃସ୍ଥାପିତ କରାଯାଇଥିଲା [HBSS, ୨୦ ମିମି ଗ୍ଲୁକୋଜ୍, ୨୦% ଭ୍ରୁଣ ଗୋମାଂସୀ) ସିରମ୍, ପେନିସିଲିନ୍ (୫୦ ୟୁ/ମିଲି) ଏବଂ ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟୋମାଇସିନ୍ (୦.୦୫ ମିଗ୍ରା/ମିଲି)]; ପ୍ରୋପିଡିୟମ ଆୟୋଡାଇଡ୍ ସହିତ କୋଷ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମତା ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରନ୍ତୁ ଏବଂ କୋଷ ଘନତାକୁ ୧×୧୦୬ ରୁ ୨×୧୦୬ କୋଷ/ମିଲିରେ ଆଡଜଷ୍ଟ କରନ୍ତୁ। ପ୍ରବାହ ସାଇଟୋମେଟ୍ରି ପୂର୍ବରୁ, ସସପେନସନକୁ 50 μm କୋଷ ଷ୍ଟ୍ରେନର ମାଧ୍ୟମରେ ଫିଲ୍ଟର କରାଯାଇଥିଲା।
ଫ୍ଲୋ ସାଇଟୋମିଟର। FACSAria III ମେସିନ୍ (BD ବାୟୋସାଇନ୍ସ) ଏବଂ FACSDiva ସଫ୍ଟୱେର୍ (BD ବାୟୋସାଇନ୍ସ, ସଂସ୍କରଣ 8.0.1) ବ୍ୟବହାର କରି 4°C ରେ କୋଷ ସଜାଡ଼ି କରାଯାଇଥିଲା। ~2800 ଇଭେଣ୍ଟ/ସେକେଣ୍ଡ ହାରରେ 20 psi ଚାପରେ 100 μm ନୋଜଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରି କୋଷ ସସପେନସନ୍ ସଜାଡ଼ି ଦିଆଯାଇଥିଲା। ଯେହେତୁ ପାରମ୍ପରିକ ଗେଟିଂ ମାନଦଣ୍ଡ (କୋଷ ଆକାର, ବାଇମୋଡାଲ୍ ପାର୍ଥକ୍ୟ ଏବଂ ବିକ୍ଷିପ୍ତତା ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟ) ଅନ୍ୟ କୋଷ ପ୍ରକାରରୁ PN ର ସଠିକ୍ ପୃଥକୀକରଣ ସୁନିଶ୍ଚିତ କରିପାରିବ ନାହିଁ, ତେଣୁ mitoYFP+ ​​ଏବଂ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ mitoYFP − ମୂଷାରେ YFP ତୀବ୍ରତା ଏବଂ ଅଟୋଫ୍ଲୋରେସେନ୍ସର ସିଧାସଳଖ ତୁଳନା ଉପରେ ଆଧାରିତ ଗେଟିଂ ରଣନୀତି ସ୍ଥିର କରାଯାଇଛି। YFP ଏକ 488 nm ଲେଜର ଲାଇନ ସହିତ ନମୁନାକୁ ବିକିରଣ କରି ଉତ୍ତେଜିତ ହୁଏ, ଏବଂ 530/30 nm ବ୍ୟାଣ୍ଡ ପାସ୍ ଫିଲ୍ଟର ବ୍ୟବହାର କରି ସିଗନାଲ ଚିହ୍ନଟ ହୁଏ। mitoYFP+ ​​ମୂଷାରେ, Rosa26-mitoYFP ରିପୋର୍ଟର ଜିନର ଆପେକ୍ଷିକ ଶକ୍ତି ମଧ୍ୟ ନ୍ୟୁରୋନାଲ୍ ବଡି ଏବଂ ଆକ୍ସନ୍ ଖଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକୁ ପୃଥକ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ। 7-AAD କୁ 561 nm ହଳଦିଆ ଲେଜର ସାହାଯ୍ୟରେ ଉତ୍ତେଜିତ କରାଯାଏ ଏବଂ ମୃତ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ବାଦ ଦେବା ପାଇଁ 675/20 nm ବ୍ୟାଣ୍ଡପାସ୍ ଫିଲ୍ଟର ସାହାଯ୍ୟରେ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଏ। ଏକ ସମୟରେ ଆଷ୍ଟ୍ରୋସାଇଟ୍ସକୁ ପୃଥକ କରିବା ପାଇଁ, କୋଷ ସସପେନସନକୁ ACSA-2-APC ସହିତ ରଙ୍ଗ ଦିଆଯାଇଥିଲା, ତା'ପରେ ନମୁନାକୁ 640 nm ଲେଜର ଲାଇନ ସହିତ ବିକିରଣ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ସିଗନାଲକୁ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ 660/20 nm ବ୍ୟାଣ୍ଡପାସ୍ ଫିଲ୍ଟର ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା।
ସଂଗୃହିତ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗେସନ୍ (୧୧୧୦ rpm, ୫ ମିନିଟ୍, ୪°C) ଦ୍ୱାରା ପେଲେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ବ୍ୟବହାର ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ -୮୦°C ରେ ସଂରକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରକ୍ରିୟାଗତ ପରିବର୍ତ୍ତନଶୀଳତାକୁ କମ କରିବା ପାଇଁ Mfn2cKO ମୂଷା ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର ଲିଟର ପିଲଗୁଡ଼ିକୁ ସମାନ ଦିନରେ ବର୍ଗୀକୃତ କରାଯାଇଥିଲା। FACS ତଥ୍ୟ ଉପସ୍ଥାପନା ଏବଂ ବିଶ୍ଳେଷଣ FlowJo ସଫ୍ଟୱେର୍ (FlowJo LLC, ଆଶଲ୍ୟାଣ୍ଡ, ଓରେଗନ୍, USA) ବ୍ୟବହାର କରି କରାଯାଇଥିଲା।
ଉପରେ ଉଲ୍ଲେଖ କରାଯାଇଛି (59), ପରବର୍ତ୍ତୀ mtDNA ପରିମାଣୀକରଣ ପାଇଁ ସଜାଯାଇଥିବା ନ୍ୟୁରନଗୁଡ଼ିକରୁ DNA ପୃଥକ କରିବା ପାଇଁ ପ୍ରକୃତ-ସମୟ PCR ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ। ବିଭିନ୍ନ ସଂଖ୍ୟକ କୋଷରେ qPCR ଚଲାଇ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଭାବରେ ରେଖୀୟତା ଏବଂ ସୀମା ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ପରୀକ୍ଷା କରାଯାଇଥିଲା। ସଂକ୍ଷେପରେ, 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 ଏବଂ proteinase K (200 ng/ml) ବିଶିଷ୍ଟ ଏକ lysis ବଫରରେ 300 PN ସଂଗ୍ରହ କରନ୍ତୁ ଏବଂ 55°C 120 ମିନିଟ୍ ରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ। ପ୍ରୋଟିନେଜ୍ K ର ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ନିଷ୍କ୍ରିୟତା ନିଶ୍ଚିତ କରିବା ପାଇଁ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 95°C ରେ ଆହୁରି ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା। mt-Nd1 ପାଇଁ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଏକ TaqMan ପ୍ରୋବ୍ (ଥର୍ମୋ ଫିସର) ବ୍ୟବହାର କରି, mtDNA କୁ 7900HT ରିଅଲ୍-ଟାଇମ୍ PCR ସିଷ୍ଟମ (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକେସନ୍) ରେ ଅର୍ଦ୍ଧ-ପରିମାଣାତ୍ମକ PCR ଦ୍ୱାରା ମାପ କରାଯାଇଥିଲା। ବିଜ୍ଞାନ, କ୍ୟାଟାଲଗ୍ ନମ୍ବର Mm04225274_s1), mt-Nd6 (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍, କ୍ୟାଟାଲଗ୍ ନମ୍ବର AIVI3E8) ଏବଂ 18S (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍, କ୍ୟାଟାଲଗ୍ ନମ୍ବର Hs99999901_s1) ଜିନ୍।
ପ୍ରୋଟିଓମ୍ ନମୁନା ପ୍ରସ୍ତୁତି। ଦ୍ରବଣକୁ 95°C ରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଗରମ କରି ଏବଂ ସୋନିକେଟ କରି, ଲିସିସ୍ ବଫରରେ [6 M ଗୁଆନିଡିନ୍ କ୍ଲୋରାଇଡ୍, 10 mM ଟ୍ରିସ୍ (2-କାର୍ବୋକ୍ସିଥାଇଲ୍) ଫସଫାଇନ୍ ହାଇଡ୍ରୋକ୍ଲୋରାଇଡ୍, 10 mM କ୍ଲୋରୋଆସେଟାମାଇଡ୍ ଏବଂ 100 mM ଟ୍ରିସ୍- HCl ରେ ଲାଇସ୍ ଫ୍ରୋଜେନ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ ପେଲେଟ୍]। 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ବାୟୋରପ୍ଟର (ଡାଏଜେନୋଡ୍) ରେ (30 ସେକେଣ୍ଡ ପଲ୍ସ / 30 ସେକେଣ୍ଡ ବିରତି ଅବଧି)। ନମୁନାକୁ 20 mM ଟ୍ରିସ୍-HCl (pH 8.0) ରେ 1:10 ରେ ଦ୍ରବୀଭୂତ କରାଯାଇଥିଲା, 300 ng ଟ୍ରିପ୍ସିନ୍ ସୁନା (ପ୍ରୋମେଗା) ସହିତ ମିଶ୍ରିତ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ପାଚନ ହାସଲ କରିବା ପାଇଁ ରାତାରାତି 37°C ରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ଦ୍ୱିତୀୟ ଦିନରେ, ନମୁନାକୁ 20,000 ଗ୍ରାମରେ 20 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଜ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ସୁପରନାଟାଣ୍ଟକୁ 0.1% ଫର୍ମିକ ଏସିଡ୍ ସହିତ ଦ୍ରବୀଭୂତ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ଦ୍ରବଣକୁ ସ୍ୱୟଂ-ନିର୍ମିତ ଷ୍ଟେଜ୍ ଟିପ୍ସ ସହିତ ଡିସଲ୍ଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ନମୁନାକୁ ଏକ SpeedVac ଉପକରଣ (Eppendorf କନସେଣ୍ଟ୍ରେଟର ପ୍ଲସ୍ 5305) ରେ 45°C ତାପମାତ୍ରାରେ ଶୁଖାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତାପରେ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ 0.1% ଫର୍ମିକ ଏସିଡ୍ ରେ ସସପେଣ୍ଡ କରାଯାଇଥିଲା। ସମସ୍ତ ନମୁନା ସମାନ ବ୍ୟକ୍ତି ଦ୍ୱାରା ଏକ ସମୟରେ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇଥିଲା। ଆଷ୍ଟ୍ରୋସାଇଟ୍ ନମୁନା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବା ପାଇଁ, 4 μg ଡିସଲ୍ଟେଡ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ଏକ ଟାଣ୍ଡେମ୍ ମାସ ଟ୍ୟାଗ୍ (TMT10plex, କ୍ୟାଟାଲଗ୍ ନମ୍ବର 90110, ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ସହିତ ଲେବଲ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହାର ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ରୁ TMT ରିଏଜେଣ୍ଟ ଅନୁପାତ 1:20 ଥିଲା। TMT ଲେବଲିଂ ପାଇଁ, 0.8 mg TMT ରିଏଜେଣ୍ଟକୁ 70 μl ଆନହାଇଡ୍ରସ୍ ACN ରେ ପୁନଃସ୍ଥାପିତ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ଶୁଖିଲା ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କୁ 0.1 M TEAB (ଟ୍ରାଇଥାଇଲାମୋନିୟମ୍ ବାଇକାର୍ବୋନେଟ୍) ର 9 μl ରେ ପୁନଃଗଠିତ କରାଯାଇଥିଲା, ଯେଉଁଥିରେ ACN ରେ 7 μl TMT ରିଏଜେଣ୍ଟ ଯୋଡା ଯାଇଥିଲା। ସାନ୍ଦ୍ରତା 43.75% ଥିଲା। 60 ମିନିଟ୍ ଇନକ୍ୟୁବେସନ୍ ପରେ, ପ୍ରତିକ୍ରିୟାକୁ 2 μl 5% ହାଇଡ୍ରୋକ୍ସିଲାମାଇନ୍ ସହିତ ନିବାରଣ କରାଯାଇଥିଲା। ଲେବଲ ହୋଇଥିବା ପେପ୍ଟାଇଡଗୁଡ଼ିକୁ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା, ଶୁଖାଯାଇଥିଲା, 0.1% ଫର୍ମିକ ଏସିଡ୍ (FA) ର 200μl ରେ ପୁନଃସ୍ଥାପିତ କରାଯାଇଥିଲା, ଦୁଇଟି ଭାଗରେ ବିଭକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତାପରେ ସ୍ୱୟଂ-ନିର୍ମିତ ଷ୍ଟେଜଟିପ୍ସ ବ୍ୟବହାର କରି ଡିସଲ୍ଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା। UltiMate 3000 ଅଲ୍ଟ୍ରା ହାଇ ପରଫର୍ମାନ୍ସ ଲିକ୍ୱିଡ୍ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫ୍ (UltiMate 3000 ଅଲ୍ଟ୍ରା ହାଇ ପରଫର୍ମାନ୍ସ ଲିକ୍ୱିଡ୍ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫ୍) ବ୍ୟବହାର କରି, ଦୁଇଟି ଅର୍ଦ୍ଧାଂଶ ମଧ୍ୟରୁ ଗୋଟିଏକୁ 1mm x 150mm ଆକ୍ୱିଟି କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫିକ୍ ସ୍ତମ୍ଭରେ 130Å1.7μm C18 କଣିକାରେ ପରିପୂର୍ଣ୍ଣ କରାଯାଇଥିଲା (ୱାଟର, କ୍ୟାଟାଲଗ୍ ନମ୍ବର SKU: 186006935)। ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍)। 30μl/ମିନିଟ୍ ପ୍ରବାହ ହାରରେ ପେପ୍ଟାଇଡଗୁଡ଼ିକୁ ପୃଥକ କରନ୍ତୁ, 1% ରୁ 50% ବଫର B ରୁ 85 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ପୃଥକ କରନ୍ତୁ ଯାହାର ପର୍ଯ୍ୟାୟକ୍ରମେ ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ 96 ମିନିଟ୍, 50% ରୁ 95% ବଫର B ରୁ 3 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ, ତାପରେ 95% ବଫର B ପାଇଁ 8 ମିନିଟ୍; ବଫର A ହେଉଛି 5% ACN ଏବଂ 10 mM ଆମୋନିୟମ୍ ବାଇକାର୍ବୋନେଟ୍ (ABC), ଏବଂ ବଫର B ହେଉଛି 80% ACN ଏବଂ 10 mM ABC। ପ୍ରତି 3 ମିନିଟ୍ ରେ ଭଗ୍ନାଂଶ ସଂଗ୍ରହ କରନ୍ତୁ ଏବଂ ସେଗୁଡ଼ିକୁ ଦୁଇଟି ଗୋଷ୍ଠୀରେ (1 + 17, 2 + 18, ଇତ୍ୟାଦି) ମିଶ୍ରଣ କରନ୍ତୁ ଏବଂ ଏକ ଭାକ୍ୟୁମ୍ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଜ୍‌ରେ ଶୁଖାଇ ଦିଅନ୍ତୁ।
LC-MS/MS ବିଶ୍ଳେଷଣ। ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି ପାଇଁ, ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସ (ନମ୍ବର r119.aq) କୁ 25 ସେମି, 75 μm ଭିତର ବ୍ୟାସ PicoFrit ବିଶ୍ଳେଷଣାତ୍ମକ ସ୍ତମ୍ଭ (ନୂତନ ଅବଜେକ୍ଟିଭ୍ ଲେନ୍ସ, ଅଂଶ ସଂଖ୍ୟା PF7508250) ରେ ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ ମାଧ୍ୟମ (ଡକ୍ଟର ମାଇସ୍, ମ୍ୟାଟ୍), Use EASY-nLC 1200 (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍, ଜର୍ମାନୀ) ସହିତ ସଜ୍ଜିତ ଥିଲା। ସ୍ତମ୍ଭଟିକୁ 50°C ରେ ରଖା ଯାଇଥିଲା। ବଫର୍ A ଏବଂ B ଯଥାକ୍ରମେ ପାଣିରେ 0.1% ଫର୍ମିକ ଏସିଡ୍ ଏବଂ 80% ACN ରେ 0.1% ଫର୍ମିକ ଏସିଡ୍ ଅଟେ। ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସକୁ 65 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 6% ରୁ 31% ବଫର B ଏବଂ 31% ରୁ 50% ବଫର B ରୁ 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହାର ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ 200 nl/ମିନିଟ୍ ଥିଲା। ଏଲୁଟେଡ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ଅର୍ବିଟ୍ରାପ୍ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟର୍ (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ରେ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ପ୍ରିକ୍ସରର୍ m/z ମାପ 350 ରୁ 1500 m/z ରେଞ୍ଜରେ 120,000 ରିଜୋଲ୍ୟୁସନ୍ ସହିତ କରାଯାଏ। 27% ସାଧାରଣୀକରଣ ସଂଘର୍ଷ ଶକ୍ତି ବ୍ୟବହାର କରି, 2 ରୁ 6 ଚାର୍ଜ ଅବସ୍ଥା ସହିତ ସବୁଠାରୁ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ପ୍ରିକ୍ସରର୍ ଉଚ୍ଚ ଶକ୍ତି C ଟ୍ରାପ୍ ଡିସୋସିଏସନ୍ (HCD) କ୍ଲିଭେଜ୍ ପାଇଁ ଚୟନ କରାଯାଏ। ଚକ୍ର ସମୟ 1 ସେକେଣ୍ଡରେ ସେଟ୍ କରାଯାଇଛି। ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଖଣ୍ଡର m/z ମୂଲ୍ୟ 5×104 ର ସବୁଠାରୁ କ୍ଷୁଦ୍ରତମ AGC ଲକ୍ଷ୍ୟ ଏବଂ 86 ms ର ସର୍ବାଧିକ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ ସମୟ ବ୍ୟବହାର କରି ଆୟନ୍ ଟ୍ରାପ୍ ରେ ମାପ କରାଯାଇଥିଲା। ଖଣ୍ଡନ ପରେ, ପ୍ରିକ୍ସରର୍ କୁ 45 ସେକେଣ୍ଡ ପାଇଁ ଗତିଶୀଳ ବର୍ଜନ ତାଲିକାରେ ରଖାଯାଇଥିଲା। TMT-ଲେବଲ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ଏକ 50 ସେମି, 75 μm ଆକ୍ଲେମ୍ ପେପ୍‌ମ୍ୟାପ୍ ସ୍ତମ୍ଭ (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍, କ୍ୟାଟାଲଗ୍ ନମ୍ବର 164942) ରେ ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ସ୍ଥାନାନ୍ତର ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରାକୁ ଏକ ଅର୍ବିଟ୍ରାପ୍ ଲୁମୋସ୍ ଟ୍ରାଇବ୍ରିଡ୍ ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟର୍ (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ରେ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା ଉଚ୍ଚ-କ୍ଷେତ୍ର ଅସମମିତ୍ରିକ ତରଙ୍ଗରୂପ ଆୟନ୍ (FAIMS) ଉପକରଣ (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ସହିତ ସଜ୍ଜିତ ଥିଲା। ସିଙ୍କ୍ରୋନାଇଜେସନ୍ ପ୍ରିକର୍ସର୍ ଉପରେ ଆଧାର କରି ଚୟନ କରାଯାଇଥିବା MS3 ଟି TMT ରିପୋର୍ଟ ଆୟନ୍ ସିଗନାଲ ମାପ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ। ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ପୃଥକୀକରଣ EASY-nLC 1200 ରେ କରାଯାଇଥିଲା, 90% ରେଖୀୟ ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ ଏଲୁସନ୍ ବ୍ୟବହାର କରି, 6% ରୁ 31% ବଫର ସାନ୍ଦ୍ରତା ସହିତ; ବଫର A ଥିଲା 0.1% FA, ଏବଂ ବଫର B ଥିଲା 0.1% FA ଏବଂ 80% ACN। ବିଶ୍ଳେଷଣାତ୍ମକ ସ୍ତମ୍ଭଟି 50°C ରେ ପରିଚାଳିତ ହୁଏ। FAIMS କ୍ଷତିପୂରଣ ଭୋଲଟେଜ୍ ଅନୁସାରେ ମୂଳ ଫାଇଲ୍ ବିଭାଜିତ କରିବା ପାଇଁ ଫ୍ରିଷ୍ଟାଇଲ୍ (ସଂସ୍କରଣ 1.6, ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ।
ପ୍ରୋଟିନ୍ ଚିହ୍ନଟ ଏବଂ ପରିମାଣୀକରଣ। ସମନ୍ୱିତ ଆଣ୍ଡ୍ରୋମେଡା ସର୍ଚ୍ଚ ଇଞ୍ଜିନ୍ ବ୍ୟବହାର କରି, MaxQuant ସଂସ୍କରଣ 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) ବ୍ୟବହାର କରି ମୂଳ ତଥ୍ୟ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। Aequorea victoria ରୁ ପ୍ରାପ୍ତ Cre recombinase ଏବଂ YFP କ୍ରମ ସହିତ, ମାଉସ୍ ରେଫରେନ୍ସ ପ୍ରୋଟିଓମ୍ (Proteome ID UP000000589, ମେ 2017 ରେ UniProt ରୁ ଡାଉନଲୋଡ୍) ର କାନୋନିକାଲ୍ କ୍ରମ ଏବଂ ଆଇସୋଫର୍ମ କ୍ରମ ପାଇଁ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଫ୍ରାଗମେଣ୍ଟ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା ସନ୍ଧାନ କରାଯାଇଥିଲା। ମେଥିଓନାଇନ୍ ଅକ୍ସିଡେସନ୍ ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ N-ଟର୍ମିନାଲ୍ ଆସିଟେଲେସନ୍ ପରିବର୍ତ୍ତନଶୀଳ ପରିବର୍ତ୍ତନ ଭାବରେ ସେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା; ସିଷ୍ଟାଇନ୍ କାର୍ବାମୋୟଲ୍ ମିଥାଇଲେସନ୍ ସ୍ଥିର ପରିବର୍ତ୍ତନ ଭାବରେ ସେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ପାଚନ ପାରାମିଟରଗୁଡ଼ିକୁ "ସ୍ପେସିଟିଟି" ଏବଂ "ଟ୍ରାଇପସିନ୍/P" ରେ ସେଟ୍ କରାଯାଇଛି। ପ୍ରୋଟିନ୍ ଚିହ୍ନଟ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଏବଂ ରେଜର ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ର ସର୍ବନିମ୍ନ ସଂଖ୍ୟା 1; ଅନନ୍ୟ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ର ସର୍ବନିମ୍ନ ସଂଖ୍ୟା 0। ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମାନଚିତ୍ର ମେଳ ଖାଇବାର ସର୍ତ୍ତରେ, ପ୍ରୋଟିନ୍ ଚିହ୍ନଟ ହାର 0.01 ଥିଲା। "ଦ୍ୱିତୀୟ ପେପ୍ଟାଇଡ୍" ବିକଳ୍ପ ସକ୍ଷମ ହୋଇଛି। ବିଭିନ୍ନ ମୂଳ ଫାଇଲଗୁଡ଼ିକ ମଧ୍ୟରେ ସଫଳ ଚିହ୍ନଟକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରିବା ପାଇଁ "ଚାଳନ ମଧ୍ୟରେ ମେଳ" ବିକଳ୍ପ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ଲେବଲ୍-ମୁକ୍ତ ପରିମାଣ (LFQ) (60) ପାଇଁ LFQ ସର୍ବନିମ୍ନ ଅନୁପାତ ଗଣନା 1 ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ପ୍ରତ୍ୟେକ ସମୟ ବିନ୍ଦୁରେ ଅତି କମରେ ଗୋଟିଏ ଜିନୋଟାଇପ୍ ଗୋଷ୍ଠୀରେ ଅତି କମରେ ଦୁଇଟି ବୈଧ ମୂଲ୍ୟ ପାଇଁ LFQ ତୀବ୍ରତା ଫିଲ୍ଟର କରାଯାଏ, ଏବଂ 0.3 ପ୍ରସ୍ଥ ସହିତ ଏକ ସାଧାରଣ ବଣ୍ଟନରୁ ଏକ୍ସଟ୍ରାପୋଲେଟ୍ କରାଯାଏ ଏବଂ 1.8 ତଳକୁ ଘୁଞ୍ଚାଯାଏ। LFQ ଫଳାଫଳ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବା ପାଇଁ Perseus କମ୍ପ୍ୟୁଟିଂ ପ୍ଲାଟଫର୍ମ (https://maxquant.net/perseus/) ଏବଂ R (https://r-project.org/) ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ଡିଫରେନ୍ସିଆଲ୍ ଏକ୍ସପ୍ରେଶନ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ (61) ପାଇଁ ଲିମା ସଫ୍ଟୱେର୍ ପ୍ୟାକେଜ୍ ରୁ ଏକ ଦୁଇ-ପାଖ ମଡରେଟ୍ t ପରୀକ୍ଷା ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା। ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally ଏବଂ pheatmap ବ୍ୟବହାର କରି ଅନୁସନ୍ଧାନମୂଳକ ତଥ୍ୟ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଏ। TMT-ଆଧାରିତ ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ସ ତଥ୍ୟକୁ MaxQuant ସଂସ୍କରଣ 1.6.10.43 ବ୍ୟବହାର କରି ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ୟୁନିପ୍ରୋଟର ମାନବ ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ସ ଡାଟାବେସ୍ ରୁ କଞ୍ଚା ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ସ ଡାଟା ଖୋଜନ୍ତୁ, ଯାହା ସେପ୍ଟେମ୍ବର 2018 ରେ ଡାଉନଲୋଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ବିଶ୍ଳେଷଣରେ ନିର୍ମାତାଙ୍କ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରଦାନ କରାଯାଇଥିବା ଆଇସୋଟୋପ୍ ପ୍ୟୁରିଟି ସଂଶୋଧନ ଫ୍ୟାକ୍ଟର ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ। ଡିଫରେନ୍ସିଆଲ୍ ଏକ୍ସପ୍ରେଶନ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ R ରେ ଲିମା ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ମୂଳ ତଥ୍ୟ, ଡାଟାବେସ୍ ସନ୍ଧାନ ଫଳାଫଳ, ଏବଂ ଡାଟା ବିଶ୍ଳେଷଣ କାର୍ଯ୍ୟପ୍ରବାହ ଏବଂ ଫଳାଫଳ ସବୁ ଡାଟା ସେଟ୍ ଚିହ୍ନଟକାରୀ PXD019690 ସହିତ PRIDE ପାର୍ଟନର ରିପୋଜିଟୋରୀ ମାଧ୍ୟମରେ ପ୍ରୋଟିଓମଏକ୍ସଚେଞ୍ଜ ଆଲାଏନ୍ସରେ ସଂରକ୍ଷିତ ଅଛି।
କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଆନୋଟେକ୍ସନ ବିଶ୍ଳେଷଣକୁ ସମୃଦ୍ଧ କରିଥାଏ। 8 ସପ୍ତାହରେ ଡାଟା ସେଟ୍ ହୋଇଥିବା କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଆନୋଟେକ୍ସନ ପଦଗୁଡ଼ିକର ସମୃଦ୍ଧତା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବା ପାଇଁ Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) ଉପକରଣ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 1)। ସଂକ୍ଷେପରେ, LC-MS/MS (ଟାଣ୍ଡେମ୍ ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି) ଡାଟା ବିଶ୍ଳେଷଣରୁ ପ୍ରାପ୍ତ ପରିମାଣାତ୍ମକ ପ୍ରୋଟିନ୍ ତାଲିକା ନିମ୍ନଲିଖିତ ଫିଲ୍ଟର ମାନଦଣ୍ଡ ସହିତ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ: Mus musculus କୁ ପ୍ରଜାତି ଏବଂ ପୃଷ୍ଠଭୂମି ଭାବରେ ଚୟନ କରାଯାଇଛି, ଏବଂ ବର୍ଗ ଦର୍ଶାଏ ଯେ Benjamini ଦ୍ୱାରା 0.05 କିମ୍ବା ତା’ଠାରୁ କମ୍ ସମୃଦ୍ଧି ପାଇଁ ବିନ୍ୟାସିତ P ମୂଲ୍ୟକୁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ବିବେଚନା କରାଯାଇଛି। ଏହି ଗ୍ରାଫ୍ ପାଇଁ, ସମୃଦ୍ଧ P ମୂଲ୍ୟ ଉପରେ ଆଧାରିତ ପ୍ରତ୍ୟେକ କ୍ଲଷ୍ଟରରେ ଶୀର୍ଷ ପାଞ୍ଚଟି ଅତିରିକ୍ତ ବର୍ଗ ଦର୍ଶାଯାଇଛି। ଏକାଧିକ t-ପରୀକ୍ଷଣ ବ୍ୟବହାର କରି, Benjamini, Krieger, ଏବଂ Yekutieli (Q = 5%) ର ଦୁଇ-ସ୍ତରୀୟ ରେଖୀୟ ବୁଷ୍ଟ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ରମ ବ୍ୟବହାର କରି, ପ୍ରତ୍ୟେକ ବର୍ଗରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପ୍ରାର୍ଥୀମାନଙ୍କ ଉପରେ ସମୟ-ପାଠ୍ୟକ୍ରମ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରକାଶନ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଏ, ଏବଂ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଧାଡ଼ିକୁ ପୃଥକ ଭାବରେ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଏ। ଏକ ସ୍ଥିର SD ଗ୍ରହଣ କରିବାର କୌଣସି ଆବଶ୍ୟକତା ନାହିଁ।
ଏହି ଅଧ୍ୟୟନର ଫଳାଫଳକୁ ପ୍ରକାଶିତ ଡାଟାବେସ୍ ସହିତ ତୁଳନା କରିବା ଏବଂ ଚିତ୍ର 1 ରେ ଏକ ଭେନ୍ ଚିତ୍ର ସୃଷ୍ଟି କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ପରିମାଣାତ୍ମକ ପ୍ରୋଟିନ୍ ତାଲିକାକୁ MitoCarta 2.0 ଆନୋଟେସନ୍ସ (24) ସହିତ ମିଶ୍ରଣ କରିଛୁ। ଚିତ୍ର ସୃଷ୍ଟି କରିବା ପାଇଁ ଅନଲାଇନ୍ ଉପକରଣ ଡ୍ର ଭେନ୍ ଚିତ୍ର (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ।
ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ସ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ପରିସଂଖ୍ୟାନ ପ୍ରକ୍ରିୟା ବିଷୟରେ ବିସ୍ତୃତ ସୂଚନା ପାଇଁ, ଦୟାକରି ସାମଗ୍ରୀ ଏବଂ ପଦ୍ଧତିର ସମ୍ପୃକ୍ତ ବିଭାଗ ଦେଖନ୍ତୁ। ଅନ୍ୟ ସମସ୍ତ ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ, ସମ୍ପୃକ୍ତ କିମ୍ବଦନ୍ତୀରେ ବିସ୍ତୃତ ସୂଚନା ମିଳିପାରିବ। ଅନ୍ୟଥା ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ନ ହେଲେ, ସମସ୍ତ ତଥ୍ୟକୁ ମଧ୍ୟମ ± SEM ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରାଯାଇଛି, ଏବଂ ସମସ୍ତ ପରିସଂଖ୍ୟାନ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଗ୍ରାଫପ୍ୟାଡ୍ ପ୍ରିଜମ୍ 8.1.2 ସଫ୍ଟୱେର୍ ବ୍ୟବହାର କରି କରାଯାଇଥିଲା।
ଏହି ଆର୍ଟିକିଲର ପରିପୂରକ ସାମଗ୍ରୀ ପାଇଁ, ଦୟାକରି http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 ଦେଖନ୍ତୁ।
ଏହା ଏକ ଖୋଲା ପ୍ରବେଶ ପ୍ରବନ୍ଧ ଯାହା କ୍ରିଏଟିଭ୍ କମନ୍ସ ଆଟ୍ରିବ୍ୟୁସନ୍-ଅଣ-ବାଣିଜ୍ୟିକ ଲାଇସେନ୍ସର ନିୟମାବଳୀ ଅଧୀନରେ ବଣ୍ଟନ କରାଯାଇଛି, ଯାହା ଯେକୌଣସି ମାଧ୍ୟମରେ ବ୍ୟବହାର, ବଣ୍ଟନ ଏବଂ ପୁନରୁତ୍ପାଦନକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ, ଯଦି ଶେଷ ବ୍ୟବହାର ବାଣିଜ୍ୟିକ ଲାଭ ପାଇଁ ନୁହେଁ ଏବଂ ମୂଳ କାର୍ଯ୍ୟ ସଠିକ୍ ବୋଲି ଆଧାରିତ। ସନ୍ଦର୍ଭ।
ଟିପ୍ପଣୀ: ଆମେ କେବଳ ଆପଣଙ୍କୁ ଆପଣଙ୍କର ଇମେଲ୍ ଠିକଣା ପ୍ରଦାନ କରିବାକୁ କହୁଛୁ ଯାହା ଦ୍ଵାରା ଆପଣ ପୃଷ୍ଠାକୁ ସୁପାରିଶ କରୁଥିବା ବ୍ୟକ୍ତି ଜାଣିପାରିବେ ଯେ ଆପଣ ତାଙ୍କୁ ଇମେଲ୍ ଦେଖିବାକୁ ଚାହୁଁଛନ୍ତି ଏବଂ ଏହା ସ୍ପାମ୍ ନୁହେଁ। ଆମେ କୌଣସି ଇମେଲ୍ ଠିକଣା କ୍ୟାପଚର କରିବୁ ନାହିଁ।
ଏହି ପ୍ରଶ୍ନଟି ଆପଣ ଜଣେ ପରିଦର୍ଶକ କି ନାହିଁ ତାହା ପରୀକ୍ଷା କରିବା ଏବଂ ସ୍ୱୟଂଚାଳିତ ସ୍ପାମ୍ ଦାଖଲକୁ ରୋକିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ।
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. ଲାରସନ |
ଅକାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ନ୍ୟୁରନଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ସ ବିଶ୍ଳେଷଣରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ନ୍ୟୁରୋଡିଜେନେରେସନକୁ ପ୍ରତିହତ କରିବା ପାଇଁ ମେଟାବୋଲିକ୍ ପ୍ରୋଗ୍ରାମଗୁଡ଼ିକ ସକ୍ରିୟ ହୋଇଥାଏ।
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. ଲାରସନ |
ଅକାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ନ୍ୟୁରନଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ସ ବିଶ୍ଳେଷଣରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ନ୍ୟୁରୋଡିଜେନେରେସନକୁ ପ୍ରତିହତ କରିବା ପାଇଁ ମେଟାବୋଲିକ୍ ପ୍ରୋଗ୍ରାମଗୁଡ଼ିକ ସକ୍ରିୟ ହୋଇଥାଏ।
© 2020 ବିଜ୍ଞାନର ଉନ୍ନତି ପାଇଁ ଆମେରିକୀୟ ଆସୋସିଏସନ୍ | ସମସ୍ତ ଅଧିକାର ସଂରକ୍ଷିତ | AAAS ହେଉଛି HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ଏବଂ COUNTER ର ଅଂଶୀଦାର | ସାଇନ୍ସ ଆଡଭାନ୍ସ ISSN 2375-2548 |