କୋଷ ଅଂଶୀକରଣ ଏବଂ ହୋମିଓଷ୍ଟାସିସ୍ ବଜାୟ ରଖିବା ପାଇଁ ସିକ୍ରେଟୋରୀ ପାଥୱେରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସଜାଣି ଅତ୍ୟନ୍ତ ଜରୁରୀ। ସେଲ୍-ମଧ୍ୟସ୍ଥତା ସଜାଣି ବ୍ୟତୀତ, ସିକ୍ରେଟୋରୀ ପରିବହନ ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ କିନେସିନ୍ ସଜାଣିରେ ଲିପିଡ୍‌ର ଭୂମିକା ଏକ ଦୀର୍ଘକାଳୀନ ମୌଳିକ ପ୍ରଶ୍ନ ଯାହା ଏପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଉତ୍ତର ଦିଆଯାଇ ନାହିଁ। ଏଠାରେ, ଆମେ 3D ଏକକାଳୀନ ବହୁରଙ୍ଗୀ ଉଚ୍ଚ-ରିଜୋଲ୍ୟୁସନ୍ ରିଅଲ୍-ଟାଇମ୍ ଇମେଜିଂ କରି ପ୍ରମାଣିତ କରୁ ଯେ ନୂତନ ଭାବରେ ସଂଶ୍ଳେଷିତ ଗ୍ଲାଇକୋସିଲଫସଫାଟିଡିଲିନୋସିଟଲ୍-ସ୍ଥାବର ପ୍ରୋଟିନ୍ ବହୁତ ଲମ୍ବା ସେରାମାଇଡ୍ ଲିପିଡ୍ ମୋଇଟିଜ୍ ସହିତ କ୍ଲଷ୍ଟର କରାଯାଇଛି ଏବଂ ସ୍ୱତନ୍ତ୍ର ଏଣ୍ଡୋପ୍ଲାଜମ୍ ନେଟ୍ ପ୍ରସ୍ଥାନ ସ୍ଥାନରେ ବର୍ଗୀକୃତ କରାଯାଇଛି, ଯାହା ଟ୍ରାନ୍ସମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଦ୍ୱାରା ବ୍ୟବହୃତ ହେଉଛି। ଏହା ସହିତ, ଆମେ ଦେଖାଉଛୁ ଯେ ଏଣ୍ଡୋପ୍ଲାଜମିକ୍ ରେଟିକୁଲମ୍ ମେମ୍ବ୍ରାନ୍ ରେ ସେରାମାଇଡ୍‌ର ଚେନ୍ ଲମ୍ବ ଏହି ସଜାଣି ଚୟନ ପାଇଁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ। ଆମର ଅଧ୍ୟୟନ ସିକ୍ରେଟୋରୀ ପାଥୱେରେ ସିଲେକ୍ଟିଭ୍ ରପ୍ତାନି ସ୍ଥାନରେ ଲିପିଡ୍ ଚେନ୍ ଲମ୍ବ ଉପରେ ଆଧାରିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ କାର୍ଗୋଗୁଡ଼ିକୁ ବର୍ଗୀକୃତ କରିବା ପାଇଁ ପ୍ରଥମ ପ୍ରତ୍ୟକ୍ଷ ଭିଭୋ ପ୍ରମାଣ ପ୍ରଦାନ କରେ।
ୟୁକାରିଓଟିକ୍ କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ, ଏଣ୍ଡୋପ୍ଲାଜମିକ୍ ରେଟିକୁଲମ୍ (ER) ରେ ସଂଶ୍ଳେଷିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ଗୁଡ଼ିକୁ ପରିବହନ ସମୟରେ ସେମାନଙ୍କର ଉପଯୁକ୍ତ କୋଷୀୟ ଗନ୍ତବ୍ୟସ୍ଥଳ (1) କୁ ପହଞ୍ଚାଇବା ପାଇଁ ସିକ୍ରେଟୋରୀ ପାଥୱେ ମାଧ୍ୟମରେ ସଜାଯାଇଥାଏ। ଆବରଣ-ମଧ୍ୟସ୍ଥତା ସଜାଣି ସହିତ, ଏହା ଦୀର୍ଘ ସମୟ ଧରି ଅନୁମାନ କରାଯାଇଥିଲା ଯେ କିଛି ଲିପିଡ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରୋଟିନ୍ (2-5) ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ଡୋମେନ୍‌ରେ କ୍ଲଷ୍ଟର କରି ଚୟନାତ୍ମକ ପ୍ରସ୍ଥାନ ବିନ୍ଦୁ ଭାବରେ ମଧ୍ୟ କାର୍ଯ୍ୟ କରିପାରିବେ। ତଥାପି, ଏହି ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଲିପିଡ୍-ଆଧାରିତ ମେକାନିଜିମ୍ ପ୍ରମାଣ କରିବା ପାଇଁ ଏପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ସିଧାସଳଖ ଇନ ଭିଭୋ ପ୍ରମାଣର ଅଭାବ ଅଛି। ଏହି ମୌଳିକ ସମସ୍ୟାର ସମାଧାନ ପାଇଁ, ଆମେ ଇଷ୍ଟରେ ଅଧ୍ୟୟନ କରିଥିଲୁ ଯେ କିପରି ଗ୍ଲାଇକୋସିଲଫସଫାଟିଡିଲିନୋସିଟଲ୍ (GPI) ଆଙ୍କର୍ଡ ପ୍ରୋଟିନ୍ (GPI-APs) ER ରୁ ପୃଥକ ଭାବରେ ରପ୍ତାନି କରାଯାଏ। GPI-APs ବିଭିନ୍ନ ପ୍ରକାରର ଲିପିଡ୍-ସଂଯୁକ୍ତ କୋଷ ପୃଷ୍ଠ ପ୍ରୋଟିନ୍ (6, 7)। GPI-AP ହେଉଛି ଗ୍ଲାଇକୋଲିପିଡ୍ ମୋଇଟି (GPI ଆଙ୍କର୍) ମାଧ୍ୟମରେ ପ୍ଲାଜ୍ମା ଝିଲ୍ଲୀର ବାହ୍ୟ ପତ୍ରିକା ସହିତ ସଂଲଗ୍ନ ଏକ ସିକ୍ରେଟେଡ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍। ସେମାନେ ER ଲୁମେନ୍ (8) ରେ ରକ୍ଷଣଶୀଳ ପରବର୍ତ୍ତୀ ଅନୁବାଦ ପରିବର୍ତ୍ତନ ଭାବରେ GPI ଆଙ୍କର୍ ଗ୍ରହଣ କରନ୍ତି। ସଂଲଗ୍ନ ହେବା ପରେ, GPI-AP ଗୋଲଗି ଉପକରଣ (5, 9) ଦେଇ ER ରୁ ପ୍ଲାଜମା ମେମ୍ବ୍ରେନକୁ ଯାଏ। GPI ଆଙ୍କର୍ସର ଉପସ୍ଥିତି ଯୋଗୁଁ GPI-AP ଗୁଡ଼ିକୁ ସିକ୍ରେଟୋରୀ ପାଥୱେ (5, 9, 10) ସହିତ ଟ୍ରାନ୍ସମେମ୍ବ୍ରେନ ସ୍ରେକିତ ପ୍ରୋଟିନ (ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ପ୍ଲାଜମା ମେମ୍ବ୍ରେନ ପ୍ରୋଟିନ ସମେତ) ଠାରୁ ପୃଥକ ଭାବରେ ପରିବହନ କରାଯାଏ। ଈଷ୍ଟ କୋଷରେ, GPI-AP ଗୁଡ଼ିକୁ ଏଣ୍ଡୋପ୍ଲାଜମିକ୍ ରେଟିକୁଲମ୍‌ରେ ଅନ୍ୟ ସିକ୍ରେଟ ପ୍ରୋଟିନଠାରୁ ପୃଥକ କରାଯାଏ, ଏବଂ ତା’ପରେ ଆବରଣ ପ୍ରୋଟିନ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସ II (COPII) (6, 7) ଦ୍ୱାରା ଆଚ୍ଛାଦିତ ଅନନ୍ୟ ଭେସିକଲ୍ସରେ ପ୍ୟାକେଜ୍ କରାଯାଏ। ER ରପ୍ତାନି ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ ଏହି ବର୍ଗୀକରଣ ପ୍ରକ୍ରିୟାର ନିର୍ଣ୍ଣାୟକଗୁଡ଼ିକ ଅସ୍ପଷ୍ଟ, କିନ୍ତୁ ଅନୁମାନ କରାଯାଉଛି ଯେ ଏହି ଯନ୍ତ୍ର ପାଇଁ ଲିପିଡ୍ ଆବଶ୍ୟକ ହୋଇପାରେ, ବିଶେଷକରି GPI ଆଙ୍କର୍ସର ଲିପିଡ୍ ଅଂଶର ଗଠନାତ୍ମକ ପୁନଃନିର୍ମାଣ (5, 8)। ଈଷ୍ଟରେ, GPI ଲିପିଡ୍ ପୁନଃନିର୍ମାଣ GPI ସଂଲଗ୍ନ ହେବା ପରେ ତୁରନ୍ତ ଆରମ୍ଭ ହୁଏ, ଏବଂ ଅନେକ କ୍ଷେତ୍ରରେ, ଏହା ସେରାମାଇଡ୍ କୁ 26-କାର୍ବନ ଲମ୍ବା-ଶୃଙ୍ଖଳିତ ଫ୍ୟାଟି ଏସିଡ୍ (C26:0) (11, 12) ସହିତ ବାନ୍ଧିବାକୁ ବାଧ୍ୟ କରେ। C26 ସେରାମାଇଡ୍ ହେଉଛି ଏପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଇଷ୍ଟ କୋଷ ଦ୍ୱାରା ଉତ୍ପାଦିତ ମୁଖ୍ୟ ସେରାମାଇଡ୍। ଏହାକୁ ER ରେ ସଂଶ୍ଳେଷିତ କରାଯାଏ ଏବଂ ଏହାର ଅଧିକାଂଶ COPII ଭେସିକଲ୍ସ (13) ମାଧ୍ୟମରେ ଗୋଲଗି ଉପକରଣକୁ ରପ୍ତାନି କରାଯାଏ। GPI-AP ରପ୍ତାନି ପାଇଁ ବିଶେଷ ଭାବରେ ଚାଲୁଥିବା ସେରାମାଇଡ୍ ସଂଶ୍ଳେଷଣ ଆବଶ୍ୟକ (14, 15), ଏବଂ ଫଳସ୍ୱରୂପ, ଗୋଲଗି ଉପକରଣରେ ସେରାମାଇଡ୍‌ର ଇନୋସିଟଲ୍ ଫସଫେଟ୍ ସେରାମାଇଡ୍ (IPC) ରେ ରୂପାନ୍ତର GPI ଆଙ୍କର ସିନ୍ଥେସିସନ୍ (16) ଉପରେ ନିର୍ଭର କରେ। କୃତ୍ରିମ ଝିଲ୍ଲୀ ସହିତ ଜୈବଭୌତିକ ଅଧ୍ୟୟନରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ବହୁତ ଲମ୍ବା ଆସିଲ୍ ଚେନ୍ ସେରାମାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକ ଅନନ୍ୟ ଭୌତିକ ଗୁଣ ସହିତ କ୍ରମିକ ଡୋମେନ୍ ଗଠନ କରିବାକୁ ଏକାଠି ହୋଇପାରନ୍ତି (17, 18)। ଏହି ତଥ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ଏହି ପରିକଳ୍ପନାକୁ ନେଇଯାଏ ଯେ C26 ସେରାମାଇଡ୍ ଏବଂ C26 ସେରାମାଇଡ୍ ସହିତ GPI-AP ସେମାନଙ୍କର ଭୌତିକ ଗୁଣଗୁଡ଼ିକୁ ବ୍ୟବହାର କରି ଆପେକ୍ଷିକ ଭାବରେ ଅବ୍ୟବସ୍ଥିତ ER ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ଲିପିଡ୍ ପରିବେଶରେ ସୁବ୍ୟବସ୍ଥିତ ଅଞ୍ଚଳ କିମ୍ବା ଅଞ୍ଚଳରେ ଏକତ୍ରିତ ହୁଏ। ଏହା ମୁଖ୍ୟତଃ କ୍ଷୁଦ୍ର ଏବଂ ଅସମ୍ତୃପ୍ତ ଗ୍ଲିସେରୋଲିପିଡ୍ (C16:1 ଏବଂ C18:1) (19, 20) ରେ ଗଠିତ। ଏହି ଅଞ୍ଚଳଗୁଡ଼ିକୁ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ER ପ୍ରସ୍ଥାନ ସ୍ଥାନ (ERES) ଉପରେ ଚୟନମୂଳକ ଭାବରେ ଧ୍ୟାନ ଦିଆଯିବ, ଯେଉଁଠାରେ ସେରାମାଇଡ୍ ଏବଂ ସେରାମାଇଡ୍-ଆଧାରିତ GPI-AP ସମାନ ଉତ୍ସର୍ଗୀକୃତ COPII ଭେସିକଲ୍ (5) ରେ ଗୋଲଗିକୁ ସହ-ପରିବହନ କରାଯାଇପାରିବ।
ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ, ଆମେ ସୁପର-ରିଜୋଲ୍ୟୁସନ୍ କନ୍ଫୋକାଲ୍ ରିଅଲ୍-ଟାଇମ୍ ଇମେଜିଂ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି (SCLIM) ବ୍ୟବହାର କରି ଏହି ଲିପିଡ୍-ଆଧାରିତ ଯନ୍ତ୍ରକୁ ସିଧାସଳଖ ପରୀକ୍ଷଣ କରିଛୁ, ଯାହା ଏକ ଅତ୍ୟାଧୁନିକ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି କୌଶଳ ଯାହା ଏକକାଳୀନ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟଲି ଲେବଲ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣ କରିପାରିବ। ତ୍ରି-ରଙ୍ଗୀ ଏବଂ ତ୍ରି-ପରିମାଣୀୟ (3D) ଚିତ୍ରଗୁଡିକ ଜୀବନ୍ତ କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ଅତ୍ୟନ୍ତ ଉଚ୍ଚ ରିଜୋଲ୍ୟୁସନ୍ ଏବଂ ଗତି (21, 22) ରଖେ।
ଆମେ ପ୍ରଥମେ S. cerevisiae ରେ ER ଛାଡିବା ପରେ ଟ୍ରାନ୍ସମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ସ୍କ୍ରିଏଟେଡ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ରୁ C26 ସେରାମାଇଡ୍ ଗ୍ରୁପ୍ ସହିତ ସାଧାରଣ GPI-AP କିପରି ସ୍କ୍ରିନ୍ କରାଯାଇଥିଲା ତାହା ଆହୁରି ବ୍ୟାଖ୍ୟା କରିବା ପାଇଁ SCLIM ପ୍ରଯୁକ୍ତିବିଦ୍ୟା ପ୍ରୟୋଗ କରିଥିଲୁ। ER ର ବର୍ଗୀକରଣ ଯାଞ୍ଚ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ଏକ ଜେନେଟିକ୍ ସିଷ୍ଟମ୍ ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ ଯାହା ERES ରେ ପ୍ରବେଶ କରୁଥିବା ନୂତନ ସଂଶ୍ଳେଷିତ କାର୍ଗୋକୁ ସିଧାସଳଖ ଦୃଶ୍ୟମାନ କରିପାରିବ (7, 23)। କାର୍ଗୋ ଭାବରେ, ଆମେ ସବୁଜ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ ପ୍ରୋଟିନ୍ (GFP) ସହିତ ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା C26 ସେରାମାଇଡ୍-ଆଧାରିତ GPI-AP Gas1 ଏବଂ ନିକଟ-ଇନଫ୍ରାରେଡ୍ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ ପ୍ରୋଟିନ୍ (iRFP) ସହିତ ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା ଟ୍ରାନ୍ସମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ସ୍କ୍ରିଏଟେଡ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ Mid2 ବାଛିଥିଲୁ, ଯାହା ଉଭୟ ପ୍ଲାଜ୍ମା ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ (24-26) କୁ ଲକ୍ଷ୍ୟ କରିଥାଏ। sec31-1 ତାପମାତ୍ରା-ସମ୍ବେଦନଶୀଳ ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟରେ, ଏହି ଦୁଇଟି କାର୍ଗୋ ଏକ ଗାଲାକ୍ଟୋଜ୍-ଇଣ୍ଡ୍ୟୁସିବଲ୍ ପ୍ରମୋଟର୍ ଏବଂ ଏକ ଗଠନାତ୍ମକ ERES ମାର୍କର ଅଧୀନରେ ପ୍ରକାଶିତ ହୋଇଥାଏ। ଅତ୍ୟଧିକ ତାପମାତ୍ରା (37°C) ରେ, କାରଣ sec31-1 ମ୍ୟୁଟେସନ୍ COPII କୋଟ୍ ଉପାଦାନ Sec31 ର କାର୍ଯ୍ୟକୁ ପ୍ରଭାବିତ କରେ ଯାହା COPII ଅଙ୍କୁରିତ ହେବା ଏବଂ ER ରପ୍ତାନିକୁ ବାଧା ଦିଏ, ନୂତନ ସଂଶ୍ଳେଷିତ କାର୍ଗୋ ER (23) ରେ ଜମା ହୁଏ। କମ୍ ତାପମାତ୍ରା (24°C) କୁ ଥଣ୍ଡା କରିବା ପରେ, sec31-1 ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ କୋଷଗୁଡ଼ିକ ସିକ୍ରେଟୋରୀ ଅଞ୍ଚଳରୁ ପୁନରୁଦ୍ଧାର ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ସଂଗୃହିତ ନୂତନ ସିନ୍ଥେଟିକ୍ କାର୍ଗୋ ER ରୁ ରପ୍ତାନି ହେବା ଆରମ୍ଭ ହୋଇଥିଲା। CLIM ଭିଜୁଆଲାଇଜେସନ୍ ଦେଖାଇଥିଲା ଯେ 37°C ରେ ଇନକ୍ୟୁବେସନ୍ ପରେ ଏବଂ ତାପରେ 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 24°C ରେ ମୁକ୍ତ ହେବା ପରେ ଅଧିକାଂଶ ନୂତନ ସଂଶ୍ଳେଷିତ Gas1-GFP ଏବଂ Mid2-iRFP sec31-1 ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ କୋଷଗୁଡ଼ିକର ER ରେ ଜମା ହୋଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 1)। ଯେହେତୁ Mid2-iRFP ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ER ମେମ୍ବ୍ରାନରେ ବଣ୍ଟନ କରାଯାଇଛି, ଏବଂ Gas1-GFP ଘନିଷ୍ଠ ଏବଂ ବିଚ୍ଛିନ୍ନ ER ମେମ୍ବ୍ରାନ୍ କ୍ଷେତ୍ରରେ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଛି, ସେମାନଙ୍କର ବଣ୍ଟନ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଭିନ୍ନ (ଚିତ୍ର 1, A ରୁ C ଏବଂ ମୁଭି S1)। ଏହା ସହିତ, ଚିତ୍ର 1D ରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ପରି, Gas1-GFP କ୍ଲଷ୍ଟରରେ Mid2-iRFP ନାହିଁ। ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକ ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ GPI-AP ଏବଂ ଟ୍ରାନ୍ସମେମ୍ବ୍ରାନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଭାବରେ ବିଭିନ୍ନ ER ମେମ୍ବ୍ରାନ୍ ଅଞ୍ଚଳରେ ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା। Gas1-GFP କ୍ଲଷ୍ଟରଟି mCherry ର COPII କୋଟ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ Sec13 (ଚିତ୍ର 1, E ଏବଂ F, ଏବଂ ମୁଭି S1) (23) ସହିତ ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ERES ସହିତ ସଂଲଗ୍ନ।
sec31-1 କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଗାଲାକ୍ଟୋଜ୍-ପ୍ରେରିତ ସ୍ରାବ, ଏକ ଲମ୍ବା ଆସିଲ୍ ଚେନ୍ (C26) ସେରାମାଇଡ୍ GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, ସବୁଜ) ଏବଂ ଟ୍ରାନ୍ସମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ Mid2-iRFP (TMP, ନୀଳ) ପ୍ରକାଶ କରନ୍ତି ଏବଂ ଏହି ଗଠନମୂଳକ ERES ଲେବଲ୍ Sec13-mCherry (ERES, ମାଜେଣ୍ଟା) 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 37°C ରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟେଡ୍ ହୋଇଥିଲା, 24°C କୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ ହୋଇଥିଲା, ଏବଂ 5 ମିନିଟ୍ ପରେ SCLIM ଦ୍ୱାରା ପ୍ରତିଛବି କରାଯାଇଥିଲା। (A ରୁ C) ଏକ ସମତଳ (A) ର ଏକ ପ୍ରତିନିଧି ମିଶ୍ରିତ କିମ୍ବା ଏକକ 2D ପ୍ରତିଛବି, 10 z-ସେକ୍ସନ (B) ର ଏକ 2D ପ୍ରୋଜେକ୍ସନ୍ ପ୍ରତିଛବି କିମ୍ବା କାର୍ଗୋ ଏବଂ ERES ମାର୍କର (C) ର ଏକ 3D କୋଷ ଗୋଲାର୍ଦ୍ଧ ପ୍ରତିଛବି ଦେଖାଏ। ସ୍କେଲ୍ ବାର୍ 1μm (A ଏବଂ B)। ସ୍କେଲ୍ ୟୁନିଟ୍ ହେଉଛି 0.551μm (C)। Gas1-GFP ବିଚ୍ଛିନ୍ନ ER ଅଞ୍ଚଳ କିମ୍ବା କ୍ଲଷ୍ଟରରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିଲା, ଯେତେବେଳେ Mid2-iRFP ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ସମଗ୍ର ER ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ (C) ରେ ବଣ୍ଟନ କରାଯାଇଥିଲା। (D) ଗ୍ରାଫ୍ ଧଳା ତୀର ରେଖା (ବାମ) ସହିତ Gas1-GFP କ୍ଲଷ୍ଟରରେ Gas1-GFP ଏବଂ Mid2-iRFP ର ଆପେକ୍ଷିକ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ତୀବ୍ରତା ଦେଖାଉଛି। AU, ମନମୁଖୀ ୟୁନିଟ୍। (E ଏବଂ F) 3D ପ୍ରତିଛବିକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ ଯାହା ସାମଗ୍ରୀ ଏବଂ ERES ଚିହ୍ନକୁ ମିଶ୍ରଣ କରେ। ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ERES ନିକଟରେ Gas1-GFP କ୍ଲଷ୍ଟରଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା। ସ୍କେଲ୍ ୟୁନିଟ୍ ହେଉଛି 0.551μm। (F) ଧଳା କଠିନ ତୀର ERES ସହିତ ଜଡିତ Gas1-GFP କ୍ଲଷ୍ଟରକୁ ଚିହ୍ନିତ କରେ। ମଧ୍ୟ ଏବଂ ଡାହାଣ ପ୍ୟାନେଲଗୁଡ଼ିକ ମିଶ୍ରିତ ବିସ୍ତାରିତ 3D ପ୍ରତିଛବି ଏବଂ ଚୟନିତ Gas1-GFP କ୍ଲଷ୍ଟରର ଏକ ଘୂର୍ଣ୍ଣିତ ଦୃଶ୍ୟ ଦେଖାଏ।
Gas1-GFP କ୍ଲଷ୍ଟର ଏବଂ ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ERES ମଧ୍ୟରେ ଘନିଷ୍ଠ ସ୍ଥାନିକ ସମ୍ପର୍କ ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ Gas1-GFP ଚୟନାତ୍ମକ ERES ରେ ପ୍ରବେଶ କରିପାରିବ, ଯାହା ER ଛାଡିବା ପାଇଁ Mid2-iRFP ଦ୍ୱାରା ବ୍ୟବହୃତ ଚୟନାତ୍ମକତା ଠାରୁ ଭିନ୍ନ। ଏହି ସମ୍ଭାବନାକୁ ସମାଧାନ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ କେବଳ ଗୋଟିଏ କିମ୍ବା ଦୁଇଟି ସାମଗ୍ରୀ ପାଇଁ ERES ଅନୁପାତ ପରିମାଣ କରିଛୁ (ଚିତ୍ର 2, A ରୁ C)। ଆମେ ପାଇଲୁ ଯେ ଅଧିକାଂଶ ERES (70%) କେବଳ ଗୋଟିଏ ପ୍ରକାରର କାର୍ଗୋ ଧାରଣ କରିଥାଏ। ଚିତ୍ର 2C ର ତଳ ଚିତ୍ର କେବଳ Gas1-GFP (ଚିତ୍ର 1) କିମ୍ବା କେବଳ Mid2-iRFP (ଚିତ୍ର 2) ସହିତ ERES ର ଦୁଇଟି ସାଧାରଣ ଉଦାହରଣ ଦେଖାଏ। ବିପରୀତରେ, ପ୍ରାୟ 20% ERES ରେ ଦୁଇଟି କାର୍ଗୋ ଥାଏ ଯାହା ସମାନ କ୍ଷେତ୍ରରେ ଓଭରଲାପ୍ ହୁଏ। ଏହା ଦେଖାଗଲା ଯେ କିଛି ERES (10%) ରେ ଦୁଇ ପ୍ରକାରର କାର୍ଗୋ ଥାଏ, କିନ୍ତୁ ସେଗୁଡ଼ିକୁ ସ୍ପଷ୍ଟ ଭାବରେ ଭିନ୍ନ କ୍ଷେତ୍ରରେ ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା। ତେଣୁ, ଏହି ପରିସଂଖ୍ୟାନ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦର୍ଶାଏ ଯେ ER ରପ୍ତାନି ହେବା ପରେ, GPI-AP Gas1-GFP ଏବଂ ଟ୍ରାନ୍ସମେମ୍ବ୍ରେନ କାର୍ଗୋ Mid2-iRFP ଭିନ୍ନ ERES ରେ ବିଭକ୍ତ କରାଯାଇଛି (ଚିତ୍ର 2D)। ଏହି ସଜାଡ଼ିବା ଦକ୍ଷତା ପୂର୍ବ ଜୈବ ରାସାୟନିକ ବିଶ୍ଳେଷଣ (6) ଏବଂ ରୂପଗତ ନିର୍ଣ୍ଣୟ (7) ସହିତ ବହୁତ ସୁସଙ୍ଗତ। ଆମେ ERES (ଚିତ୍ର 2E ଏବଂ ମୁଭି S2) ରେ ପ୍ରବେଶ କରୁଥିବା କ୍ୱାରେଣ୍ଟାଇନ୍ ହୋଇଥିବା କାର୍ଗୋର ଆଚରଣ ମଧ୍ୟ ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣ କରିପାରିବା। ଚିତ୍ର 2E ଦର୍ଶାଉଛି ଯେ Gas1-GFP (ପ୍ୟାନେଲ୍ 3) କିମ୍ବା Mid2-iRFP (ପ୍ୟାନେଲ୍ 4) ର କେବଳ ଏକ ଛୋଟ ଅଂଶ ଗୋଟିଏ ପାର୍ଶ୍ୱରୁ ERES ରେ ପ୍ରବେଶ କରେ ଏବଂ ଏକ ବିଚ୍ଛିନ୍ନ କ୍ଷେତ୍ରରେ ଆବଦ୍ଧ। ଚିତ୍ର 2E ର ପ୍ୟାନେଲ୍ 5 ଦର୍ଶାଉଛି ଯେ Gas1-GFP ଏବଂ Mid2-iRFP କେତେକ ସମୟରେ ସମାନ ERES ରେ ମିଳିଥାଏ, କିନ୍ତୁ ସେମାନେ ବିଭିନ୍ନ ପାର୍ଶ୍ୱରୁ ପ୍ରବେଶ କରନ୍ତି ଏବଂ ପୃଥକ ଅଞ୍ଚଳରେ କେନ୍ଦ୍ରିତ ହୁଅନ୍ତି ଯାହା ବିଭିନ୍ନ COPII ଭେସିକଲ୍ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରିପାରେ। ଆମେ ଏହା ମଧ୍ୟ ନିଶ୍ଚିତ କରିଛୁ ଯେ C26 ସେରାମାଇଡ୍-ଆଧାରିତ GPI-AP Gas1 ର ଚୟନାତ୍ମକ ERES ଭାବରେ ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷିତ ପୃଥକୀକରଣ ଏବଂ ବର୍ଗୀକରଣ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କାରଣ ଅନ୍ୟ ଏକ ଟ୍ରାନ୍ସମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ସ୍ରେକସନ୍ କାର୍ଗୋ, GFP-ଟ୍ୟାଗ୍ ହୋଇଥିବା ପ୍ଲାଜମା ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ Axl2 (27), Mid2-iRFP ସହିତ ସମାନ ଆଚରଣ ଦେଖାଉଛି। (ଚିତ୍ର S1 ଏବଂ ମୁଭି S3)। ନୂତନ ସଂଶ୍ଳେଷିତ Axl2-GFP Mid2-iRFP (ଚିତ୍ର S1, A ଏବଂ B) ପରି ER ମେମ୍ବ୍ରାନ୍ ମାଧ୍ୟମରେ ବଣ୍ଟନ କରାଯାଏ, ଏବଂ ଅଧିକାଂଶ ERES (ଚିତ୍ର S1, B ରୁ D) ରେ Mid2-iRFP ସହିତ ସହ-ସ୍ଥାନୀୟ କରାଯାଏ। ଚିତ୍ର 1 ର ପ୍ୟାନେଲ୍ 1 ଏବଂ 2। S1C ERES ର ଦୁଇଟି ସାଧାରଣ ଉଦାହରଣ ଦେଖାଏ ଯେଉଁଠାରେ ଦୁଇଟି ଟ୍ରାନ୍ସମେମ୍ବ୍ରାନ୍ କାର୍ଗୋ ଓଭରଲାପ୍ ହୁଏ। ଏହି କ୍ଷେତ୍ରରେ, ଉଭୟ ସାମଗ୍ରୀ ERES ରେ ଏକତ୍ର ପ୍ରବେଶ କରନ୍ତି (ଚିତ୍ର S1E, ପ୍ୟାନେଲ୍ 3 ଏବଂ ମୁଭି S3)।
ଗାଲାକ୍ଟୋଜ୍ ଇନଡୁସିବଲ୍ ସ୍ରାବକୁ ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା sec31-1 କୋଷ, Gas1-GFP (GPI-AP, ସବୁଜ) ଏବଂ Mid2-iRFP (TMP, ନୀଳ) ଏବଂ Sec13-mCherry (ERES, ମାଜେଣ୍ଟା) ଲେବଲ୍ କରୁଥିବା ଗଠନାତ୍ମକ ERES କୁ 37 ରେ ରଖାଯାଇଛି। °C ରେ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଟିଂ କରିବା ପରେ, ସ୍ରାବ ବ୍ଲକକୁ ମୁକ୍ତ କରିବା ପାଇଁ 24 °C କୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରନ୍ତୁ, ଏବଂ 20 ମିନିଟ୍ ପରେ SCLIM ସହିତ ପ୍ରତିଛବି କରନ୍ତୁ। (A ରୁ C) ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରୁଥିବା 2D ପ୍ରୋଜେକ୍ସନ୍ ପ୍ରତିଛବି (A; ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 1μm) କିମ୍ବା 3D କୋଷ ଗୋଲାର୍ଦ୍ଧ ପ୍ରତିଛବି (B ଏବଂ C; ସ୍କେଲ୍ ୟୁନିଟ୍, 0.456μm) କାର୍ଗୋ ଏବଂ ERES ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନିତ 10 z-ସେକ୍ସନ। (B) ରେ ଥିବା ତଳ ପ୍ୟାନେଲ୍ ଏବଂ (C) ରେ ଥିବା ପ୍ୟାନେଲ୍ କେବଳ ERES (ମାଜେଣ୍ଟା) [Gas1-GFP (ଧୂସର) ଏବଂ Mid2-iRFP (ହାଲୁକା ନୀଳ)] ରେ ଉପସ୍ଥିତ ସାମଗ୍ରୀ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରିବା ପାଇଁ ପ୍ରକ୍ରିୟାକୃତ ପ୍ରତିଛବି ପ୍ରଦର୍ଶନ କରେ। (C) ଖୋଲା ତୀର: ERES କେବଳ ଗୋଟିଏ ଜିନିଷ ବହନ କରେ (1 ରୁ 4)। ଧୂସର ତୀର: ERES ରେ ପୃଥକ କାର୍ଗୋ ଥାଏ (5)। ଧଳା କଠିନ ତୀର: ସହ-ସ୍ଥିତ କାର୍ଗୋ ଧାରଣ କରୁଥିବା ERES। ତଳେ: ଚୟନିତ ଏକକ ERES ରେ କେବଳ Gas1-GFP (1) କିମ୍ବା Mid2-iRFP (2) ଥାଏ। ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 100 nm। (D) (C) ରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ଫଟୋମାଇକ୍ରୋଗ୍ରାଫ୍ ର ପରିମାଣ। କେବଳ ଗୋଟିଏ ଜିନିଷ (Gas1-GFP କିମ୍ବା Mid2-iRFP), ପୃଥକ କାର୍ଗୋ ଏବଂ ଓଭରଲାପିଂ କାର୍ଗୋ ଧାରଣ କରୁଥିବା ERES ର ହାରାହାରି ପ୍ରତିଶତ। ତିନୋଟି ସ୍ୱାଧୀନ ପରୀକ୍ଷଣରେ, 54 କୋଷରେ n=432। ତ୍ରୁଟି ବାର୍ = SD। ଦୁଇ-ଲାଞ୍ଜ ଅସଂଯୁକ୍ତ t ପରୀକ୍ଷା। *** P = 0.0002। (E) (C) ଚିହ୍ନିତ କ୍ୱାରଣ୍ଟାଇନ୍ ହୋଇଥିବା କାର୍ଗୋର ଚୟନିତ ERES ର 3D ପ୍ରତିଛବି। Gas1-GFP (ସବୁଜ) (3) କିମ୍ବା Mid2-iRFP (ନୀଳ) (4) ଗୋଟିଏ ପାର୍ଶ୍ୱରୁ ERES (ମାଜେଣ୍ଟା) ରେ ପ୍ରବେଶ କରେ ଏବଂ ERES ମଧ୍ୟରେ ଏକ ଛୋଟ ଅଞ୍ଚଳରେ ସୀମିତ ହୁଏ। କେତେବେଳେ, ଉଭୟ ପ୍ରକାରର କାର୍ଗୋ ଗୋଟିଏ ପାର୍ଶ୍ୱରୁ ସମାନ ERES (5) ରେ ପ୍ରବେଶ କରନ୍ତି ଏବଂ ERES ମଧ୍ୟରେ ଏକ ବିଚ୍ଛିନ୍ନ ଅଞ୍ଚଳରେ ସୀମିତ ରହନ୍ତି। ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 100 nm।
ପରେ, ଆମେ ଏକ ପରିକଳ୍ପନା ପରୀକ୍ଷା କରିଥିଲୁ ଯେ ER ମେମ୍ବ୍ରେନରେ ଉପସ୍ଥିତ ଲମ୍ବା ଆସିଲ୍ ଚେନ୍ ସେରାମାଇଡ୍ (C26) Gas1 ର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କ୍ଲଷ୍ଟରିଂ ଏବଂ ସଜାଡ଼ିକୁ ଚୟନାତ୍ମକ ERES ରେ ଚାଳିତ କରେ। ଏଥିପାଇଁ, ଆମେ ଏକ ପରିବର୍ତ୍ତିତ ଇଷ୍ଟ ଷ୍ଟ୍ରେନ୍ GhLag1 ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ, ଯେଉଁଥିରେ ଦୁଇଟି ଅନ୍ତର୍ଜାତ ସେରାମାଇଡ୍ ସିନ୍ଥେସ୍ Lag1 ଏବଂ Lac1 କୁ GhLag1 (କପା ର Lag1 ହୋମୋଲୋଗ୍) ଦ୍ୱାରା ବଦଳାଯାଇଥିଲା, ଯାହା ଫଳରେ ଏକ ଇଷ୍ଟ ଷ୍ଟ୍ରେନ୍ ଏକ କୋଷ ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ସେରାମାଇଡ୍ ଷ୍ଟ୍ରେନ୍ ସହିତ ସୃଷ୍ଟି ହୋଇଥିଲା ଯାହା ୱାଇଲ୍ଡ ପ୍ରକାର (ଚିତ୍ର 3A) (28) ଅପେକ୍ଷା ଛୋଟ ଥିଲା। ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି (MS) ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦେଖାଇଥିଲା ଯେ ୱାଇଲ୍ଡ-ଟାଇପ୍ ଷ୍ଟ୍ରେନ୍‌ରେ, ମୋଟ ସେରାମାଇଡ୍‌ର 95% ବହୁତ ଲମ୍ବା (C26) ଚେନ୍ ସେରାମାଇଡ୍, ଯେତେବେଳେ GhLag1 ରେ, ସେରାମାଇଡ୍‌ର 85% ବହୁତ ଲମ୍ବା (C18 ଏବଂ C16)। ), କେବଳ 2% ସେରାମାଇଡ୍ ବହୁତ ଲମ୍ବା (C26) ଚେନ୍ ସେରାମାଇଡ୍। ଯଦିଓ C18 ଏବଂ C16 ସେରାମାଇଡ୍ ହେଉଛି GhLag1 ମେମ୍ବ୍ରେନ୍‌ରେ ଏପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ମୁଖ୍ୟ ସେରାମାଇଡ୍, MS ବିଶ୍ଳେଷଣ ମଧ୍ୟ ନିଶ୍ଚିତ କରିଛି ଯେ GhLag1 ଷ୍ଟ୍ରେନ୍‌ରେ ପ୍ରକାଶିତ Gas1-GFPର GPI ଆଙ୍କର୍‌ରେ C26 ସେରାମାଇଡ୍ ଅଛି, ଯାହା ଜଙ୍ଗଲୀ-ପ୍ରକାର ଲିପିଡ୍‌ ସହିତ ତୁଳନୀୟ। ଗୁଣବତ୍ତା ସମାନ (ଚିତ୍ର 3A) (26)। ତେଣୁ, ଏହାର ଅର୍ଥ ହେଉଛି ସେରାମାଇଡ୍ ପୁନଃନିର୍ମାଣ ଏନଜାଇମ୍ Cwh43 C26 ସେରାମାଇଡ୍ ପାଇଁ ଅତ୍ୟନ୍ତ ଚୟନମୂଳକ, ଯେପରି ଚିତ୍ର 26 ରେ ଦେଖାଯାଇଛି, ଏହା GhLag1 ଷ୍ଟ୍ରେନ୍‌ରେ C26 ସେରାମାଇଡ୍‌ର ଏକ ଛୋଟ ପରିମାଣରୁ GPI ଆଙ୍କର୍‌କୁ ପସନ୍ଦଯୋଗ୍ୟ ଭାବରେ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରେ। S2 (29)। ତଥାପି, GhLag1 ର କୋଷ ମେମ୍ବ୍ରେନ୍‌ରେ ମୂଳତଃ କେବଳ C18-C16 ସେରାମାଇଡ୍‌ ଥାଏ, ଯେତେବେଳେ Gas1-GFP ରେ ଏବେ ବି C26 ସେରାମାଇଡ୍‌ ଅଛି। ଏହି ତଥ୍ୟ ଏହି ଷ୍ଟ୍ରେନ୍‌କୁ ER ରେ ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ସେରାମାଇଡ୍‌ର ଆସିଲ୍ ଚେନ୍‌ ଲମ୍ବ ସମସ୍ୟାର ସମାଧାନ ପାଇଁ ଏକ ଆଦର୍ଶ ଉପକରଣ କରିଥାଏ। ଶ୍ରେଣୀ ଏବଂ ସଜାଡ଼ିବାର କାଳ୍ପନିକ ଭୂମିକା। ତା'ପରେ, ଆମେ ପ୍ରଥମେ ପାରମ୍ପରିକ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ମାଧ୍ୟମରେ sec31-1 ର ତାପମାତ୍ରା-ସମ୍ବେଦନଶୀଳ ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ ଆଲିଲ୍ ସହିତ GhLag1 ରେ କ୍ଲଷ୍ଟରରେ C26 Gas1-GFP ର ସଂଗୃହିତ ହେବାର କ୍ଷମତା ଅଧ୍ୟୟନ କରିଥିଲୁ, ଯେଉଁଠାରେ କେବଳ ଲମ୍ବା (C18-C16) ଶୃଙ୍ଖଳ ER ମେମ୍ବ୍ରାନ୍ Ceramide (ଚିତ୍ର 3) ରେ ବିଦ୍ୟମାନ। ଆମେ ଦେଖିଲୁ ଯେ sec31-1 ରେ, ଅଧିକାଂଶ Gas1-GFP କ୍ଲଷ୍ଟରରେ କେନ୍ଦ୍ରିତ ଥିଲା, ଯେତେବେଳେ sec31-1 GhLag1 ରେ ଲମ୍ବା (C18-C16) ଲମ୍ବା ସେମ୍ବ୍ରାନ୍ ER ମେମ୍ବ୍ରାନ୍ ସହିତ Gas1-GFP ମୁଖ୍ୟତଃ କ୍ଲଷ୍ଟର ହୋଇନଥିଲା ଏବଂ ସମଗ୍ର ER ମେମ୍ବ୍ରାନ୍ ରେ ବଣ୍ଟନ କରାଯାଇଥିଲା। ସଠିକ୍ ଭାବରେ କହିବାକୁ ଗଲେ, କାରଣ C26 ସେମ୍ବ୍ରାନ୍-ଆଧାରିତ କ୍ଲଷ୍ଟରିଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ERES (ଚିତ୍ର 1) ସହିତ ନିକଟତର ଭାବରେ ଜଡିତ, ଆମେ ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିଥିଲୁ ଯେ ଏହି ପ୍ରକ୍ରିୟା ER ରପ୍ତାନି ପ୍ରୋଟିନ୍ ଯନ୍ତ୍ରପାତିର କାର୍ଯ୍ୟ ମଧ୍ୟ ସାମିଲ ହୋଇପାରେ କି ନାହିଁ। GPI-AP ER ରପ୍ତାନି ପାଇଁ ଏକ ସ୍ୱତନ୍ତ୍ର COPII ସିଷ୍ଟମ୍ ବ୍ୟବହାର କରେ, ଯାହା GPI ଆଙ୍କରର ଗ୍ଲାଇକାନ୍ ଅଂଶର Ted1 ର ଗଠନାତ୍ମକ ପୁନଃନିର୍ମାଣ ଦ୍ୱାରା ସକ୍ରିୟ ଭାବରେ ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ହୁଏ (30, 31)। ପୁନଃସଂଯୋଜିତ GPI-glycan ତା'ପରେ ଟ୍ରାନ୍ସମେମ୍ବ୍ରେନ୍ କାର୍ଗୋ ରିସେପ୍ଟର p24 କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସ ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନଟ ହୁଏ, ଯାହା ପରେ ଚୟନମୂଳକ ଭାବରେ Lst1 କୁ ନିଯୁକ୍ତି କରେ, ଯାହା ପ୍ରମୁଖ COPII କାର୍ଗୋ ବାଇଣ୍ଡିଂ ସବୟୁନିଟ୍ Sec24 ର ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଆଇସୋଫର୍ମ, ଏକ GPI-AP-ସମୃଦ୍ଧ COPII ଭେସିକଲ୍ସ ଆବଶ୍ୟକ (31-33)। ତେଣୁ, ଆମେ ଏକ ଡବଲ୍ ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ ନିର୍ମାଣ କରିଥିଲୁ ଯାହା ଏହି ଏକକ ପ୍ରୋଟିନ (p24 ଜଟିଳ ଉପାଦାନ Emp24, GPI-glycan ପୁନଃନିର୍ମାଣକାରୀ ଏନଜାଇମ୍ Ted1 ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ COPII ସବୟୁନିଟ୍ Lst1) ର ବିଲୋପକୁ sec31-1 ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ ଷ୍ଟ୍ରେନ୍ ସହିତ ମିଶ୍ରଣ କରିଥିଲା, ଏବଂ ସେଗୁଡିକୁ ଅଧ୍ୟୟନ କରିଥିଲୁ ଯେ Gas1-କ୍ଲଷ୍ଟର GFP ଗଠନ କରିବା ସମ୍ଭବ କି (ଚିତ୍ର 3)। ଆମେ ଦେଖିଲୁ ଯେ sec31-1emp24Δ ଏବଂ sec31-1ted1Δ ରେ, Gas1-GFP ମୁଖ୍ୟତଃ କ୍ଲଷ୍ଟର ହୋଇନାହିଁ ଏବଂ ସମଗ୍ର ER ମେମ୍ବ୍ରେନରେ ବଣ୍ଟନ କରାଯାଇଛି, ଯେପରି ପୂର୍ବରୁ sec31-1 GhLag1 ରେ ଦେଖାଯାଇଥିଲା, ଯେତେବେଳେ sec31-1lst1Δ ରେ, Gas1-GFP sec31-1 ପରି। ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକ ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ER ମେମ୍ବ୍ରେନରେ C26 ସେରାମାଇଡର ଉପସ୍ଥିତି ବ୍ୟତୀତ, Gas1-GFPର କ୍ଲଷ୍ଟରିଂକୁ p24 କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସ ସହିତ ଯୋଡିବା ଆବଶ୍ୟକ, ଏବଂ ଏଥିପାଇଁ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ Lst1 ନିଯୁକ୍ତି ଆବଶ୍ୟକ ନାହିଁ। ତାପରେ, ଆମେ ଏହି ସମ୍ଭାବନାକୁ ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିଥିଲୁ ଯେ ER ମେମ୍ବ୍ରେନରେ ସେରାମାଇଡର ଚେନ୍ ଲମ୍ବ Gas1-GFPର ବନ୍ଧନକୁ p24 ସହିତ ନିୟନ୍ତ୍ରିତ କରିପାରିବ। ତଥାପି, ଆମେ ପାଇଲୁ ଯେ ମେମ୍ବ୍ରେନରେ C18-C16 ସେରାମାଇଡର ଉପସ୍ଥିତି p24 କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସ (ଚିତ୍ର S3 ଏବଂ S4, A ଏବଂ B) ଦ୍ୱାରା ପୁନଃନିର୍ମାଣିତ GPI-ଗ୍ଲାଇକାନ୍ସ କିମ୍ବା GPI-AP ସହିତ ବନ୍ଧନ ଏବଂ GPI-AP ରପ୍ତାନି କ୍ଷମତାକୁ ପ୍ରଭାବିତ କରେ ନାହିଁ। ନିଯୁକ୍ତି COPII ଉପପ୍ରକାର Lst1 (ଚିତ୍ର S4C)। ତେଣୁ, C26 ସେରାମାଇଡ-ନିର୍ଭର କ୍ଲଷ୍ଟରିଂ ପାଇଁ ବିଭିନ୍ନ ER ରପ୍ତାନି ପ୍ରୋଟିନ୍ ଯନ୍ତ୍ରପାତି ସହିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ଆବଶ୍ୟକ ହୁଏ ନାହିଁ, କିନ୍ତୁ ଲିପିଡ୍ ଲମ୍ବ ଦ୍ୱାରା ଚାଳିତ ଏକ ବିକଳ୍ପ ସର୍ଟିଂ ଯନ୍ତ୍ରପାତିକୁ ସମର୍ଥନ କରେ। ତାପରେ, ଆମେ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିଥିଲୁ ଯେ ER ମେମ୍ବ୍ରେନରେ ସେରାମାଇଡ୍ ଆସିଲ୍ ଚେନ୍ ଲମ୍ବ Gas1-GFPର ଚୟନାତ୍ମକ ERES ଭାବରେ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ବର୍ଗୀକରଣ ପାଇଁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ କି ନାହିଁ। ଯେହେତୁ GhLag1 ଷ୍ଟ୍ରେନରେ ଥିବା Gas1 ସର୍ଟ-ଚେନ୍ ସେରାମାଇଡ୍ ସହିତ ER ଛାଡି ପ୍ଲାଜମା ମେମ୍ବ୍ରାନ୍ (ଚିତ୍ର S5) ରେ ପ୍ରବେଶ କରେ, ଆମେ ବିଶ୍ୱାସ କରୁ ଯେ ଯଦି ସେରାମାଇଡ୍ ଆସିଲ୍ ଚେନ୍ ର ଲମ୍ବ ଦ୍ୱାରା ସଜାଣି ଚାଳିତ ହୁଏ, ତେବେ GhLag1 ଷ୍ଟ୍ରେନରେ ଥିବା Gas1 କୁ ପୁନଃନିର୍ଦ୍ଦେଶିତ ଏବଂ କ୍ରସ୍ କରାଯାଇପାରିବ। ସମାନ ମେମ୍ବ୍ରାନ୍ ସହିତ ERES ସାମଗ୍ରୀ।
(A) GhLag1 ର କୋଷ ପରଦାରେ ମୁଖ୍ୟତଃ ଛୋଟ C18-C16 ସେରାମାଇଡ୍ ଥାଏ, ଯେତେବେଳେ Gas1-GFP ର GPI ଆଙ୍କର୍ ରେ ଏବେ ବି ୱାଇଲ୍ଡ-ଟାଇପ୍ କୋଷ ପରି C26 IPC ଅଛି। ଉପରେ: ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି (MS) ଦ୍ୱାରା ୱାଇଲ୍ଡ-ଟାଇପ୍ (Wt) ଏବଂ GhLag1p ଷ୍ଟ୍ରେନର କୋଷ ପରଦାରେ ସେରାମାଇଡର ଆସାଇଲ୍ ଚେନ୍ ଲମ୍ବ ବିଶ୍ଳେଷଣ। ତଥ୍ୟ ମୋଟ ସେରାମାଇଡର ଶତକଡ଼ା ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ। ତିନୋଟି ସ୍ୱାଧୀନ ପରୀକ୍ଷଣର ହାରାହାରି। ତ୍ରୁଟି ବାର୍ = SD। ଦୁଇ-ଲାଞ୍ଜ ଅସଂଯୁକ୍ତ t ପରୀକ୍ଷା। **** P ＜0.0001। ତଳ ପ୍ୟାନେଲ୍: ୱାଇଲ୍ଡ-ଟାଇପ୍ ଏବଂ GhLag1p ଷ୍ଟ୍ରେନରେ ପ୍ରକାଶିତ Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI ଆଙ୍କର୍ ରେ ଉପସ୍ଥିତ IPC ର ଆସାଇଲ୍ ଚେନ୍ ଲମ୍ବ MS ବିଶ୍ଳେଷଣ। ତଥ୍ୟ ମୋଟ IPC ସିଗନାଲର ଶତକଡ଼ା ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ। ପାଞ୍ଚଟି ସ୍ୱାଧୀନ ପରୀକ୍ଷଣର ହାରାହାରି। ତ୍ରୁଟି ବାର୍ = SD। ଦୁଇ-ଲାଞ୍ଜ ଅସଂଯୁକ୍ତ t ପରୀକ୍ଷା। ns, ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ନୁହେଁ। P = 0.9134। (ଖ) ଗାଲାକ୍ଟୋଜ୍-ପ୍ରେରିତ Gas1-GFP ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ ଏବଂ sec31-1lst1Δ କୋଷଗୁଡ଼ିକର ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ମାଇକ୍ରୋଗ୍ରାଫ୍ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 37°C ରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 24°C ପରେ ନିୟମିତ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି କରିବାକୁ ପଠାଯାଇଥିଲା। ଧଳା ତୀର: ER Gas1-GFP କ୍ଲଷ୍ଟର। ଖୋଲା ତୀର: କ୍ଲଷ୍ଟରଡ୍ ଗ୍ୟାସ1-GFP ସମଗ୍ର ER ମେମ୍ବ୍ରାନରେ ବଣ୍ଟନ କରାଯାଇଛି, ଯାହା ER ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟପୂର୍ଣ୍ଣ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟର ରିଙ୍ଗ ଷ୍ଟେନିଂ ଦର୍ଶାଉଛି। ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 5μm। (ଗ) (ଖ) ରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ଫଟୋମାଇକ୍ରୋଗ୍ରାଫ୍ ର ପରିମାଣ। Punctate Gas1-GFP ଗଠନ ସହିତ କୋଷଗୁଡ଼ିକର ହାରାହାରି ପ୍ରତିଶତ। ତିନୋଟି ସ୍ୱାଧୀନ ପରୀକ୍ଷଣରେ, n≥300 କୋଷ। ତ୍ରୁଟି ବାର୍ = SD। ଦୁଇ-ଲାଞ୍ଜ ଅସଂଯୁକ୍ତ t ପରୀକ୍ଷା। **** P ＜0.0001।
ଏହି ସମସ୍ୟାର ସିଧାସଳଖ ସମାଧାନ ପାଇଁ, ଆମେ sec31-1 ତାପମାତ୍ରା-ସମ୍ବେଦନଶୀଳ ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ ଆଲିଲ୍ (ଚିତ୍ର 4 ଏବଂ ମୁଭି S4) ସହିତ GhLag1 ରେ Gas1-GFP ଏବଂ Mid2-iRFP ର SCLIM ଭିଜୁଆଲାଇଜେସନ୍ କରିଥିଲୁ। ER କୁ 37°C ରେ ରଖାଯିବା ପରେ ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ 24°C ରେ ମୁକ୍ତ କରାଯିବା ପରେ, ପାରମ୍ପରିକ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ ଦ୍ୱାରା ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷିତ ଭାବରେ ନୂତନ ଭାବରେ ସଂଶ୍ଳେଷିତ Gas1-GFP ର ଅଧିକାଂଶ କ୍ଲଷ୍ଟର ଏବଂ ସମଗ୍ର ER ମେମ୍ବ୍ରିନରେ ବଣ୍ଟନ କରାଯାଇ ନଥିଲା (ଚିତ୍ର 4, A ଏବଂ B)। ଏହା ସହିତ, ERES ର ଏକ ବଡ଼ ପ୍ରତିଶତ (67%) ଏଥିରେ ଦୁଇ ପ୍ରକାରର କାର୍ଗୋ ସହ-ସ୍ଥିତ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ (ଚିତ୍ର 4D)। ଚିତ୍ର 4C ର ପ୍ୟାନେଲ୍ 1 ଏବଂ 2 ରେ Gas1-GFP ଏବଂ Mid2-GFP ଉପରେ ଓଭରଲାପ୍ ହେଉଥିବା ERES ର ଦୁଇଟି ସାଧାରଣ ଉଦାହରଣ ଦେଖାଯାଇଛି। ଏହା ସହିତ, ଉଭୟ ସାମଗ୍ରୀକୁ ସମାନ ERES ରେ ନିଯୁକ୍ତି ଦିଆଯାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 4E, ପ୍ୟାନେଲ୍ 3 ଏବଂ ମୁଭି S4)। ତେଣୁ, ଆମର ଫଳାଫଳ ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ ER ମେମ୍ବ୍ରିନରେ ସେରାମାଇଡ୍ ଆସିଲ୍ ଚେନ୍ ର ଲମ୍ବ ER ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏକତ୍ରୀକରଣ ଏବଂ ବର୍ଗୀକରଣର ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ନିର୍ଣ୍ଣାୟକ।
Sec31-1 GhLag1 କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଗାଲାକ୍ଟୋଜ୍-ପ୍ରେରିତ କ୍ଷରଣ ପ୍ରକାଶ କରନ୍ତି, Gas1-GFP (GPI-AP, ସବୁଜ) ଏବଂ Mid2-iRFP (TMP, ନୀଳ) ଏବଂ ଗଠନାତ୍ମକ ERES-ଲେବଲ୍ Sec13-mCherry (ERES, ମାଜେଣ୍ଟା) 37°C ରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ ହୁଅନ୍ତୁ। 30 ମିନିଟ୍ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଜାରି ରଖନ୍ତୁ, କ୍ଷରଣ ମୁକ୍ତ କରିବା ପାଇଁ 24°C କୁ ତଳକୁ ଖସନ୍ତୁ, ଏବଂ 20 ମିନିଟ୍ ପରେ SCLIM ସହିତ ପ୍ରତିଛବି କରନ୍ତୁ। (A ରୁ C) କାର୍ଗୋ ଏବଂ ERES ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନିତ 10 z-ସେକ୍ସନର ପ୍ରତିନିଧି 2D ପ୍ରୋଜେକ୍ସନ୍ ପ୍ରତିଛବି (A; ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 1μm) କିମ୍ବା 3D କୋଷ ଗୋଲାର୍ଦ୍ଧ ପ୍ରତିଛବି (B ଏବଂ C; ସ୍କେଲ୍ ୟୁନିଟ୍, 0.45μm)। (B) ରେ ଥିବା ତଳ ପ୍ୟାନେଲ୍ ଏବଂ (C) ରେ ଥିବା ପ୍ୟାନେଲ୍ କେବଳ ERES (ମାଜେଣ୍ଟା) [Gas1-GFP (ଧୂସର) ଏବଂ Mid2-iRFP (ହାଲୁକା ନୀଳ)] ରେ ଉପସ୍ଥିତ ସାମଗ୍ରୀ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରିବା ପାଇଁ ପ୍ରକ୍ରିୟାକୃତ ପ୍ରତିଛବି ପ୍ରଦର୍ଶନ କରନ୍ତି। (C) ଧଳା ପରିପୂର୍ଣ୍ଣ ତୀର: ERES, ସାମଗ୍ରୀ ଓଭରଲାପ୍। ଖୋଲା ତୀର: ERES ରେ କେବଳ ଗୋଟିଏ ଜିନିଷ ଅଛି। ତଳ ପ୍ୟାନେଲ୍: ଚୟନିତ ERES ରେ (C) ଚିହ୍ନିତ ଓଭରଲାପ୍ ହେଉଥିବା ଜିନିଷ (1 ଏବଂ 2) ଅଛି। ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 100 nm। (D) (C) ରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ଫଟୋମାଇକ୍ରୋଗ୍ରାଫ୍ ର ପରିମାଣ। sec31-1 ଏବଂ sec31-1 GhLag1 ୟୁନିଟ୍‌ରେ, କେବଳ ଗୋଟିଏ କାର୍ଗୋ (Gas1-GFP କିମ୍ବା Mid2-iRFP) ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଛି, ଏବଂ ପୃଥକ କାର୍ଗୋ ଏବଂ ଓଭରଲାପ୍ ହେଉଥିବା କାର୍ଗୋ ପାଇଁ ERES ର ହାରାହାରି ପ୍ରତିଶତ। ତିନୋଟି ସ୍ୱାଧୀନ ପରୀକ୍ଷଣରେ, 54 କୋଷରେ n = 432 (sec31-1) ଏବଂ 47 କୋଷରେ n = 430 (sec31-1 GhLag1)। ତ୍ରୁଟି ବାର୍ = SD। ଦୁଇ-ଲାଞ୍ଜ ଅସଂଯୁକ୍ତ t ପରୀକ୍ଷା। *** P = 0.0002 (sec31-1) ଏବଂ ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1)। (E) (C) ଚିହ୍ନିତ ଓଭରଲାପ୍ ହେଉଥିବା କାର୍ଗୋ (3) ସହିତ ଚୟନିତ ERES ର 3D ପ୍ରତିଛବି। Gas1-GFP (ସବୁଜ) ଏବଂ Mid2-iRFP (ନୀଳ) ଗୋଟିଏ ପାର୍ଶ୍ୱରୁ ERES (ମାଜେଣ୍ଟା) ପାଖକୁ ଯାଆନ୍ତି ଏବଂ ସମାନ ERES ପ୍ରତିବନ୍ଧିତ କ୍ଷେତ୍ରରେ ରହନ୍ତି। ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 100 nm।
ଏହି ଅଧ୍ୟୟନ ସିକ୍ରେଟୋରୀ ପାଥୱେରେ ଲିପିଡ-ଆଧାରିତ ପ୍ରୋଟିନ କାର୍ଗୋଗୁଡ଼ିକୁ ଚୟନିତ ରପ୍ତାନି ସ୍ଥାନରେ ବର୍ଗୀକୃତ କରାଯାଇଥିବାର ପ୍ରତ୍ୟକ୍ଷ ପ୍ରମାଣ ପ୍ରଦାନ କରେ, ଏବଂ ବର୍ଗୀକରଣ ଚୟନ ପାଇଁ ଆସିଲ ଚେନ ଲମ୍ବତାର ଗୁରୁତ୍ୱ ପ୍ରକାଶ କରେ। SCLIM ନାମକ ଏକ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ଏବଂ ଅତ୍ୟାଧୁନିକ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି କୌଶଳ ବ୍ୟବହାର କରି, ଆମେ ଇଷ୍ଟରେ ନୂତନ ସଂଶ୍ଳେଷିତ Gas1-GFP (ଏକ ବହୁତ ଲମ୍ବା ଆସିଲ ଚେନ (C26) ସେରାମାଇଡ ଲିପିଡ ଅଂଶ ସହିତ ଏକ ପ୍ରମୁଖ ପ୍ଲାଜମା ମେମ୍ବ୍ରେନ GPI-AP) ପ୍ରଦର୍ଶନ କରିଛୁ। ଡିସ୍କ୍ରିଟ ER ରେ କ୍ଲଷ୍ଟର ହୋଇଥିବା ଅଞ୍ଚଳଗୁଡ଼ିକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ERES ସହିତ ଜଡିତ, ଯେତେବେଳେ ଟ୍ରାନ୍ସମେମ୍ବ୍ରେନ ସିକ୍ରେଟ ପ୍ରୋଟିନଗୁଡ଼ିକ ସମଗ୍ର ER ମେମ୍ବ୍ରେନରେ ବଣ୍ଟନ କରାଯାଏ (ଚିତ୍ର 1)। ଏହା ସହିତ, ଏହି ଦୁଇ ପ୍ରକାରର ସାମଗ୍ରୀ ଚୟନିତ ଭାବରେ ବିଭିନ୍ନ ERES ରେ ପ୍ରବେଶ କରନ୍ତି (ଚିତ୍ର 2)। ଡିସ୍କ୍ରିଟ ୱେବରେ ସେଲୁଲାର ସେରାମାଇଡର ଆସିଲ ଚେନ ଲମ୍ବ C26 ରୁ C18-C16 କୁ ହ୍ରାସ ପାଏ, Gas1-GFP କ୍ଲଷ୍ଟର ଡିସ୍କ୍ରିଟ ER ଅଞ୍ଚଳରେ ବିଚଳିତ ହୁଏ, ଏବଂ Gas1-GFP ସମାନ ERES ମାଧ୍ୟମରେ ଟ୍ରାନ୍ସମେମ୍ବ୍ରେନ ପ୍ରୋଟିନ ସହିତ ER ଛାଡିବା ପାଇଁ ପୁନଃପଥିତ ହୁଏ (ଚିତ୍ର 3 ଏବଂ ଚିତ୍ର 3)। 4)।
ଯଦିଓ GPI-AP ER ରୁ ବାହାରିବା ପାଇଁ ଏକ ବିଶେଷ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଯନ୍ତ୍ର ବ୍ୟବହାର କରେ, ଆମେ ପାଇଲୁ ଯେ C26 ସେରାମାଇଡ୍-ନିର୍ଭରଶୀଳ ପୃଥକୀକରଣ ERES ବିଶେଷଜ୍ଞତା ଆଡ଼କୁ ନେଇପାରେ ଏପରି ଡିଫରେନ୍ସିଆଲ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ଉପରେ ନିର୍ଭର କରେ ନାହିଁ (ଚିତ୍ର S4 ଏବଂ S5)। ଏହା ବଦଳରେ, ଆମର ଫଳାଫଳ ଲିପିଡ୍-ଆଧାରିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ କ୍ଲଷ୍ଟରିଂ ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ କାର୍ଗୋର ବାଦ ଦେବା ଦ୍ୱାରା ଚାଳିତ ଏକ ବିକଳ୍ପ ବର୍ଗୀକରଣ ଯନ୍ତ୍ରକୁ ସମର୍ଥନ କରେ। ଆମର ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣ ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ERES ସହିତ ଜଡିତ Gas1-GFP ଅଞ୍ଚଳ କିମ୍ବା କ୍ଲଷ୍ଟରରେ ଟ୍ରାନ୍ସମେମ୍ବ୍ରେନ୍ କ୍ଷରିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ Mid2-iRFPର ଅଭାବ ଅଛି, ଯାହା ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ C26 ସେରାମାଇଡ୍-ନିର୍ଭରଶୀଳ GPI-AP କ୍ଲଷ୍ଟର ପ୍ରାସଙ୍ଗିକ ERES ରେ ସେମାନଙ୍କର ପ୍ରବେଶକୁ ସହଜ କରିବ, ଏବଂ ସେହି ସମୟରେ, ଟ୍ରାନ୍ସମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ବାଦ ଦେବ କ୍ଷର ଏହି ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ERES ରେ ପ୍ରବେଶ କରିବ (ଚିତ୍ର 1 ଏବଂ 2)। ବିପରୀତରେ, ER ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ରେ C18-C16 ସେରାମାଇଡ୍ ର ଉପସ୍ଥିତି GPI-AP କୁ କ୍ଷେତ୍ର କିମ୍ବା କ୍ଲଷ୍ଟର ଗଠନ କରିବାକୁ ବାଧ୍ୟ କରେ ନାହିଁ, ତେଣୁ ସେମାନେ ସମାନ ERES ରେ ଟ୍ରାନ୍ସମେମ୍ବ୍ରେନ୍ କ୍ଷରିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ କୁ ବାଦ ଦିଅନ୍ତି ନାହିଁ କିମ୍ବା ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ କରନ୍ତି ନାହିଁ (ଚିତ୍ର 3 ଏବଂ 4)। ତେଣୁ, ଆମେ ପ୍ରସ୍ତାବ ଦେଉଛୁ ଯେ C26 ସେରାମାଇଡ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ERES ସହିତ ଜଡିତ ପ୍ରୋଟିନର କ୍ଲଷ୍ଟରିଂକୁ ସହଜ କରି ପୃଥକୀକରଣ ଏବଂ ବର୍ଗୀକରଣକୁ ଚଳାଇଥାଏ।
ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ER କ୍ଷେତ୍ରରେ ଏହି C26 ସେରାମାଇଡ୍-ନିର୍ଭରଶୀଳ କ୍ଲଷ୍ଟରିଂ କିପରି ହାସଲ କରିବେ? ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ସେରାମାଇଡ୍ ପାର୍ଶ୍ଵବର୍ତ୍ତୀ ଭାବରେ ପୃଥକ ହେବା ପ୍ରବୃତ୍ତି GPI-AP ଏବଂ C26 ସେରାମାଇଡ୍ ଛୋଟ ଏବଂ ଅସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଗ୍ଲାଇସେରୋଲିପିଡ୍ ଧାରଣ କରୁଥିବା ER ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ର ଅଧିକ ଅନିୟମିତ ଲିପିଡ୍ ପରିବେଶରେ ଛୋଟ ଏବଂ ତୁରନ୍ତ କ୍ରମବଦ୍ଧ ଲିପିଡ୍ ଗଠନ କରିବାକୁ କାରଣ ହୋଇପାରେ। ଗୁଣାତ୍ମକ କ୍ଲଷ୍ଟର (17, 18)। p24 ଜଟିଳ (34) ସହିତ ବନ୍ଧନ କରିବା ପରେ ଏହି ଛୋଟ ଅସ୍ଥାୟୀ କ୍ଲଷ୍ଟରଗୁଡ଼ିକୁ ଆହୁରି ବଡ଼, ଅଧିକ ସ୍ଥିର କ୍ଲଷ୍ଟରରେ ଫ୍ୟୁଜ କରାଯାଇପାରିବ। ଏହା ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ, ଆମେ ଦେଖାଇଲୁ ଯେ C26 Gas1-GFP କୁ ବଡ଼ ଦୃଶ୍ୟମାନ କ୍ଲଷ୍ଟର ଗଠନ କରିବା ପାଇଁ p24 ଜଟିଳ ସହିତ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା କରିବାକୁ ପଡିବ (ଚିତ୍ର 3)। p24 ଜଟିଳ ହେଉଛି ଇଷ୍ଟ (35) ରେ ଚାରୋଟି ଭିନ୍ନ p24 ଟ୍ରାନ୍ସମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଦ୍ୱାରା ଗଠିତ ଏକ ହେଟେରୋଜାଇଗସ୍ ଅଲିଗୋମର, ଯାହା ବହୁଭାଜକ ବନ୍ଧନ ପ୍ରଦାନ କରେ, ଯାହା ଛୋଟ GPI-AP କ୍ଲଷ୍ଟରଗୁଡ଼ିକର କ୍ରସ୍-ଲିଙ୍କିଂକୁ ନେଇପାରେ, ଯାହା ଫଳରେ ବଡ଼ ସ୍ଥିର କ୍ଲଷ୍ଟର (34) ସୃଷ୍ଟି କରେ। ସ୍ତନ୍ୟପାୟୀ ଧ୍ରୁବୀୟ ଉପକଣ୍ଠ କୋଷରେ ଗୋଲଗି ପରିବହନ ସମୟରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ପରି, GPI-APs ର ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏକ୍ଟୋଡୋମେନ୍ ମଧ୍ୟରେ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ମଧ୍ୟ ସେମାନଙ୍କର ଏକତ୍ରୀକରଣରେ ଯୋଗଦାନ କରିପାରେ (36)। ତଥାପି, ଯେତେବେଳେ C18-C16 ସେରାମାଇଡ୍ ER ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ରେ ଉପସ୍ଥିତ ଥାଏ, ଯେତେବେଳେ p24 ଜଟିଳ Gas1-GFP ସହିତ ବାନ୍ଧି ହୁଏ, ବଡ଼ ପୃଥକ କ୍ଲଷ୍ଟର ଗଠନ ହେବ ନାହିଁ। ଅନ୍ତର୍ନିହିତ ଯନ୍ତ୍ର ଲମ୍ବା ଆସିଲ୍ ଚେନ୍ ସେରାମାଇଡ୍ ର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଭୌତିକ ଏବଂ ରାସାୟନିକ ଗୁଣ ଉପରେ ନିର୍ଭର କରିପାରେ। କୃତ୍ରିମ ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ର ଜୈବଭୌତିକ ଅଧ୍ୟୟନ ଦର୍ଶାଏ ଯେ ଯଦିଓ ଲମ୍ବା (C24) ଏବଂ ଛୋଟ (C18-C16) ଆସିଲ୍ ଚେନ୍ ସେରାମାଇଡ୍ ଉଭୟ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ପୃଥକୀକରଣର କାରଣ ହୋଇପାରେ, କେବଳ ଲମ୍ବା ଆସିଲ୍ ଚେନ୍ ସେରାମାଇଡ୍ (C24) ଫିଲ୍ମକୁ ପୁନଃଆକୃତି ଦେବା ପାଇଁ ଉଚ୍ଚ ବକ୍ରତା ଏବଂ ଫିଲ୍ମ ବଙ୍କାକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରିପାରିବ। ପାରସ୍ପରିକ ସନ୍ଦର୍ଭ ମାଧ୍ୟମରେ (17, 37, 38)। ଏହା ଦେଖାଯାଇଛି ଯେ TMED2 ର ଟ୍ରାନ୍ସମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ହେଲିକ୍ସ, Emp24 ର ମାନବ ହୋଲୋଗ, ସାଇଟୋପ୍ଲାଜମିକ୍ ଲୋବ୍ୟୁଲ୍ସ (39) ରେ C18 ସେରାମାଇଡ୍-ଆଧାରିତ ସ୍ଫିଙ୍ଗୋମାଇଲିନ୍ ସହିତ ଚୟନୀକୃତ ଭାବରେ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା କରେ। ଆଣବିକ ଗତିଶୀଳତା (MD) ସିମୁଲେସନ୍ ବ୍ୟବହାର କରି, ଆମେ ପାଇଲୁ ଯେ C18 ଏବଂ C26 ସେରାମାଇଡ୍ ଉଭୟ Emp24 ଟ୍ରାନ୍ସମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ହେଲିକ୍ସର ସାଇଟୋପ୍ଲାଜମିକ୍ ଲୋବ୍ୟୁଲ୍ସ ଚାରିପାଖରେ ଜମା ହୁଏ, ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର ସମାନ ପସନ୍ଦ ଅଛି (ଚିତ୍ର S6)। ଏହା ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଯେ ଏହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ Emp24 ର ଟ୍ରାନ୍ସମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ହେଲିକ୍ସ ମେମ୍ବ୍ରାନରେ ଲିପିଡ୍‌ର ଅସମମ ବଣ୍ଟନ କରିପାରେ। ଏହା ସ୍ତନ୍ୟପାୟୀ କୋଷ ଉପରେ ଆଧାରିତ ଏକ ସାମ୍ପ୍ରତିକ ଫଳାଫଳ। ସମାନ MD ସିମୁଲେସନ୍ ମଧ୍ୟ ଇଥର ଲିପିଡ୍‌ର ଉପସ୍ଥିତି ଦେଖାଏ (40)। ତେଣୁ, ଆମେ ଅନୁମାନ କରୁଛୁ ଯେ ER26 ର ଦୁଇଟି ଲୋବ୍ୟୁଲ୍ସରେ C26 ସେରାମାଇଡ୍ ସ୍ଥାନୀୟ ଭାବରେ ସମୃଦ୍ଧ। ଯେତେବେଳେ ଲ୍ୟୁମିନାଲ୍ ଲୋବ୍ୟୁଲ୍ସରେ ଥିବା GPI-AP ସିଧାସଳଖ ମଲ୍ଟିଭାଲେଣ୍ଟ p24 ସହିତ ଯୋଡି ହୁଏ ଏବଂ ସାଇଟୋପ୍ଲାଜମିକ୍ ଲୋବ୍ୟୁଲ୍ସରେ p24 ଚାରିପାଖରେ C26 ସେରାମାଇଡ୍ ଜମା ହୁଏ, ଏହା ଆଙ୍ଗୁଠି ମାଧ୍ୟମରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏକତ୍ରୀକରଣ ଏବଂ ଝିଲ୍ଲୀ ବକ୍ରତା ସୃଷ୍ଟିକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରିପାରେ (41), ଯାହା GPI-AP କୁ ERES ସଂଲଗ୍ନ ବିଚ୍ଛିନ୍ନ ଅଞ୍ଚଳରେ ପୃଥକ କରିଥାଏ, ଯାହା ER ମେମ୍ବ୍ରଣର ଅତ୍ୟନ୍ତ ବକ୍ର ଅଞ୍ଚଳକୁ ମଧ୍ୟ ସମର୍ଥନ କରେ (42)। ପୂର୍ବ ରିପୋର୍ଟଗୁଡ଼ିକ ପ୍ରସ୍ତାବିତ ଯନ୍ତ୍ରକୁ ସମର୍ଥନ କରିଥିଲା ​​(43, 44)। ପ୍ଲାଜ୍ମା ମେମ୍ବ୍ରଣରେ ସେରାମାଇଡ୍-ଆଧାରିତ ଗ୍ଲାଇକୋସ୍ଫିଙ୍ଗୋଲିପିଡ୍ସ (GSL) ସହିତ ଅଲିଗୋଲେକ୍ଟିନ, ରୋଗଜନିତ କିମ୍ବା ଆଣ୍ଟିବଡିର ମଲ୍ଟିଭାଲେଣ୍ଟ ବନ୍ଧନ ବଡ଼ GSL ଏକତ୍ରୀକରଣକୁ ଟ୍ରିଗର କରେ, ପର୍ଯ୍ୟାୟ ପୃଥକୀକରଣକୁ ବୃଦ୍ଧି କରେ ଏବଂ ଝିଲ୍ଲୀ ବିକୃତି ଏବଂ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣୀକରଣକୁ କାରଣ କରେ (44)। ଇୱାବୁଚି ଇତ୍ୟାଦି (43) ଏହା ଦେଖାଗଲା ଯେ ଲମ୍ବା (C24) କିନ୍ତୁ ଛୋଟ ନୁହେଁ (C16) ଆସିଲ୍ ଶୃଙ୍ଖଳର ଉପସ୍ଥିତିରେ, GSL ଲାକ୍ଟୋସାଇଲସେରାମାଇଡ୍ ସହିତ ବନ୍ଧା ହୋଇଥିବା ମଲ୍ଟିଭାଲେଣ୍ଟ ଲିଗାଣ୍ଡ ବଡ଼ କ୍ଲଷ୍ଟର ଏବଂ ଝିଲ୍ଲୀ ଇନଭାଜିନେସନ ଗଠନକୁ ପ୍ରେରିତ କରିଥିଲା, ଏବଂ ଲିଫଲେଟ୍ ଉପରେ ସାଇଟୋପ୍ଲାଜମ୍ ଲିନ୍-ମଧ୍ୟସ୍ଥତା ସିଗନାଲ ଟ୍ରାନ୍ସଡକ୍ସନ୍ ଯୁଗ୍ମ ନ୍ୟୁଟ୍ରୋଫିଲ୍‌ରେ ଆସିଲ୍ ଶୃଙ୍ଖଳ ଦ୍ୱାରା ପରସ୍ପରକୁ ବିଭାଜିତ କରିଥାଏ।
ସ୍ତନ୍ୟପାୟୀ ପୋଲାରାଇଜଡ୍ ଏପିଥେଲିୟଲ୍ କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ, ଆପିକାଲ୍ ପ୍ଲାଜ୍ମା ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ସ୍ତର ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଆଣ୍ଟି-ଗୋଲଗି ନେଟୱାର୍କ (TGN)ର ସାନ୍ଦ୍ରତା GPI-AP ର ପୃଥକୀକରଣ ଏବଂ ସଜାଡ଼ିକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରେ (10, 45)। ଏହି ଏକତ୍ରୀକରଣ GPI-AP ଅଲିଗୋମରାଇଜେସନ୍ (36) ଦ୍ୱାରା ଚାଳିତ ହୁଏ, କିନ୍ତୁ ଏହା ଆମେ ଇଷ୍ଟରେ ପାଉଥିବା ସେରାମାଇଡ୍ ଚେନ୍ ଲମ୍ବ ଉପରେ ମଧ୍ୟ ନିର୍ଭର କରିପାରେ। ଯଦିଓ ସ୍ତନ୍ୟପାୟୀ GPI-AP ରେ ଏକ ଇଥର ଲିପିଡ୍-ଆଧାରିତ ଆଙ୍କର ଅଛି, ଏବଂ ଏହାର ରାସାୟନିକ ଗଠନ ବହୁତ ଲମ୍ବା ଆସାଇଲ୍ ଚେନ୍ ସେରାମାଇଡ୍ ଠାରୁ ବହୁତ ଭିନ୍ନ, ଏକ ସାମ୍ପ୍ରତିକ ଅଧ୍ୟୟନରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ଉଭୟ ଲିପିଡ୍‌ର ବିବର୍ତ୍ତନମୂଳକ ଭାବରେ ସମାନ ଭୌତିକ ଏବଂ ରାସାୟନିକ ଗୁଣ ଏବଂ କାର୍ଯ୍ୟ (40) ଅଛି। ତେଣୁ, ସ୍ତନ୍ୟପାୟୀ କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ଇଥର ଲିପିଡ୍ ଅଂଶ ଇଷ୍ଟରେ C26 ସେରାମାଇଡ୍ ସହିତ ସମାନ ହୋଇପାରେ, ଏବଂ ଏହାର ଭୂମିକା ହେଉଛି GPI-AP ଏକତ୍ରୀକରଣ ଏବଂ ସଜାଡ଼ିକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରିବା ପାଇଁ ସ୍ତନ୍ୟପାୟୀ ଲମ୍ବା-ଚେନ୍ ସେରାମାଇଡ୍ ସହିତ ଜଡିତ ହେବା। ଯଦିଓ ଏହି ସମ୍ଭାବନାକୁ ଏବେ ବି ସିଧାସଳଖ ପରୀକ୍ଷା କରିବାକୁ ପଡିବ, ପୂର୍ବ ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକ ସମର୍ଥନ କରେ ଯେ ଗୋଲଗି ଶରୀରକୁ ଲମ୍ବା ଆସିଲ୍ ଚେନ୍ ସେରାମାଇଡ୍ ପରିବହନ ସାଇଟୋପ୍ଲାଜମିକ୍ ଟ୍ରାନ୍ସଫର ପ୍ରୋଟିନ୍ ଦ୍ୱାରା କରାଯାଏ ନାହିଁ, ବରଂ ଏହା ଇଷ୍ଟ ପରି GPI ଆଙ୍କରଗୁଡ଼ିକର ସଂଶ୍ଳେଷଣ ଉପରେ ନିର୍ଭର କରେ। ତେଣୁ, ବିବର୍ତ୍ତନବାଦୀ ରକ୍ଷଣଶୀଳ ଯନ୍ତ୍ରପାତି ସମାନ ପରିବହନ ଭେସିକଲରେ ବହୁତ ଲମ୍ବା ଆସିଲ୍ ଚେନ୍ ସେରାମାଇଡ୍ ଏବଂ GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ସହ-ପରିବହନ କରିବାକୁ ସକ୍ଷମ ମନେ ହୁଏ।
ଇଷ୍ଟ ଏବଂ ସ୍ତନ୍ୟପାୟୀ ଧ୍ରୁବୀୟ ଉପକଣ୍ଠ କୋଷ ପ୍ରଣାଳୀରେ, GPI-AP ଏକତ୍ରୀକରଣ ଏବଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ପ୍ଲାଜ୍ମା ଝିଲ୍ଲୀ ପ୍ରୋଟିନରୁ ପୃଥକୀକରଣ ସମସ୍ତ କୋଷ ପୃଷ୍ଠରେ ପହଞ୍ଚିବା ପୂର୍ବରୁ ଘଟେ। ପାଲାଡିନୋ ଏବଂ ଅନ୍ୟମାନେ (48) ଜାଣିପାରିଲେ ଯେ ସ୍ତନ୍ୟପାୟୀ ଧ୍ରୁବୀୟ ଉପକଣ୍ଠ କୋଷଗୁଡ଼ିକର TGN ଉପରେ, GPI-AP କ୍ଲଷ୍ଟରିଂ କେବଳ apical ପ୍ଲାଜ୍ମା ଝିଲ୍ଲୀକୁ GPI-APs ର ଚୟନିତ ବର୍ଗୀକରଣ ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ ନୁହେଁ, ବରଂ GPI-APs ର କ୍ଲଷ୍ଟରିଂ ସଂଗଠନ ଏବଂ ଏହାର ଜୈବିକ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ମଧ୍ୟ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରେ। କୋଷ ପୃଷ୍ଠ। ଇଷ୍ଟରେ, ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ER ରେ C26 ସେରାମାଇଡ୍-ନିର୍ଭରଶୀଳ GPI-AP କ୍ଲଷ୍ଟର ପ୍ଲାଜ୍ମା ଝିଲ୍ଲୀରେ GPI-AP ର କ୍ଲଷ୍ଟର ସଂଗଠନ ଏବଂ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରିପାରିବ (24, 49)। ଏହି ମଡେଲ ସହିତ ସଂଗତ, GhLag1 କୋଷଗୁଡ଼ିକ GPI ଇନହିବିଟର କିମ୍ବା ଔଷଧ ପ୍ରତି ଆଲର୍ଜିକ ଅଟନ୍ତି ଯାହା କୋଷ କାନ୍ଥ ଅଖଣ୍ଡତାକୁ ପ୍ରଭାବିତ କରେ (28), ଏବଂ ଇଷ୍ଟ କୋଷଗୁଡ଼ିକର ମିଳନରେ ପ୍ରକ୍ଷେପିତ ଟିପ୍ ସେରାମାଇଡର କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ Gas1-GFP କ୍ଲଷ୍ଟର (49) ର ଆବଶ୍ୟକତା HLag1 କୋଷଗୁଡ଼ିକର ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଶାରୀରିକ ପରିଣାମକୁ ସୂଚିତ କରେ। GPI-AP ତ୍ରୁଟି। ତଥାପି, ଲିପିଡ୍ ଲମ୍ବ ଉପରେ ଆଧାରିତ ସଜାଡ଼ିବା ପଦ୍ଧତି ଦ୍ୱାରା କୋଷ ପୃଷ୍ଠର କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ସଂଗଠନକୁ ER ରୁ ପ୍ରୋଗ୍ରାମ କରାଯାଇଛି କି ନାହିଁ ତାହା ଅଧିକ ପରୀକ୍ଷା କରିବା ଆମର ଭବିଷ୍ୟତ ଗବେଷଣାର ବିଷୟ ହେବ।
ଏହି କାର୍ଯ୍ୟରେ ବ୍ୟବହୃତ Saccharomyces cerevisiae ଷ୍ଟ୍ରେନଗୁଡ଼ିକ ଟେବୁଲ S1 ରେ ତାଲିକାଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଛି। ଲାଇଭ୍ କୋଷ ଇମେଜିଂ ପାଇଁ SCLIM ର MMY1583 ଏବଂ MMY1635 ଷ୍ଟ୍ରେନଗୁଡ଼ିକ W303 ର ପୃଷ୍ଠଭୂମିରେ ନିର୍ମିତ ହୋଇଥିଲା। ଏକ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଟ୍ୟାଗ୍ ସହିତ Sec13-mCherry ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା ଏହି ଷ୍ଟ୍ରେନଗୁଡ଼ିକ ଏକ ପଲିମରେଜ୍ ଚେନ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା (PCR) -ଆଧାରିତ ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରି pFA6a ପ୍ଲାଜମିଡ୍ ସହିତ ଏକ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ (23) ଭାବରେ ନିର୍ମିତ ହୋଇଥିଲା। GAL1 ପ୍ରମୋଟରଙ୍କ ନିୟନ୍ତ୍ରଣରେ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସହିତ ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା Mid2-iRFP ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା ଷ୍ଟ୍ରେନ ନିମ୍ନଲିଖିତ ଭାବରେ ନିର୍ମିତ ହୋଇଥିଲା। pKTiRFP-KAN ଭେକ୍ଟରରୁ iRFP-KanMx କ୍ରମର PCR ପ୍ରଶସ୍ତିକରଣ (E. O'Shea ର ଉପହାର, Addgene plasmid ନମ୍ବର 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; ଗବେଷଣା ସମ୍ବଳ ଚିହ୍ନଟକାରୀ (RRID): Addgene_64687) ଏବଂ endogenous Mid2 ର C-ଟର୍ମିନସରେ ପ୍ରବେଶ କରାଯାଇଥିଲା। Mid2-iRFP ଜିନୋମ୍ କ୍ରମକୁ GAL1 ପ୍ରମୋଟରରେ ବୃଦ୍ଧି ଏବଂ କ୍ଲୋନ୍ କରିବା ପରେ, ଏହାକୁ ଇଣ୍ଟିଗ୍ରେସନ୍ ପ୍ଲାଜମିଡ୍ pRS306 ର Not I-Sac I ସାଇଟରେ ସଂଯୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା। ଫଳସ୍ୱରୂପ ପ୍ଲାଜମିଡ୍ pRGS7 କୁ URA3 ସ୍ଥାନ ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ କରିବା ପାଇଁ Pst I ସହିତ ରେଖୀୟ କରାଯାଇଥିଲା।
ସେଣ୍ଟ୍ରୋମିୟର (CEN) ପ୍ଲାଜମିଡରେ GAL1 ପ୍ରମୋଟରଙ୍କ ନିୟନ୍ତ୍ରଣରେ Gas1-GFP ଫ୍ୟୁଜନ୍ ଜିନ୍ ପ୍ରକାଶିତ ହୁଏ, ଯାହା ନିମ୍ନଲିଖିତ ଭାବରେ ନିର୍ମିତ। PRS416-GAS1-GFP ପ୍ଲାଜମିଡ (24) (L. Popolo ର ଉପହାର) ରୁ PCR ଦ୍ୱାରା Gas1-GFP କ୍ରମକୁ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ CEN ପ୍ଲାଜମିଡ pBEVY-GL LEU2 (C ର ଉପହାର) ର Xma I–Xho I ସ୍ଥାନରେ କ୍ଲୋନ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ମିଲର୍; ଆଡ୍ଜିନ୍ ପ୍ଲାଜମିଡ ନମ୍ବର 51225; http://n2t.net/adddene: 51225; RRID: ଆଡ୍ଜିନ୍_51225)। ଫଳସ୍ୱରୂପ ପ୍ଲାଜମିଡକୁ pRGS6 ନାମ ଦିଆଯାଇଥିଲା। Axl2-GFP ଫ୍ୟୁଜନ୍ ଜିନ୍ ମଧ୍ୟ pBEVY-GL LEU2 ଭେକ୍ଟରର GAL1 ପ୍ରମୋଟରଙ୍କ ନିୟନ୍ତ୍ରଣରେ ପ୍ରକାଶିତ ହୁଏ, ଏବଂ ଏହାର ନିର୍ମାଣ ନିମ୍ନଲିଖିତ ଭାବରେ କରାଯାଇଛି। Axl2-GFP କ୍ରମକୁ PCR ଦ୍ୱାରା pRS304-p2HSE-Axl2-GFP ପ୍ଲାଜମିଡ୍ (23) ରୁ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ pBEVY-GL LEU2 ଭେକ୍ଟରର Bam HI-Pst I ସାଇଟରେ କ୍ଲୋନ କରାଯାଇଥିଲା। ଫଳସ୍ୱରୂପ ପ୍ଲାଜମିଡ୍ କୁ pRGS12 ନାମ ଦିଆଯାଇଥିଲା। ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ ବ୍ୟବହୃତ ଅଲିଗୋନୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ସର କ୍ରମକୁ ସାରଣୀ S2 ରେ ତାଲିକାଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଛି।
ଏହି ଷ୍ଟ୍ରେନକୁ 0.2% ଆଡେନିନ୍ ଏବଂ 2% ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ [YP-ଡେକ୍ସଟ୍ରୋଜ୍ (YPD)], 2% ରାଫିନୋଜ୍ [YP-ରାଫିନୋଜ୍] ସମୃଦ୍ଧ ଇଷ୍ଟ୍ ନିର୍ଗତ ପ୍ରୋଟିନ୍ p (YP) ମାଧ୍ୟମ (1% ଇଷ୍ଟ୍ ନିର୍ଗତ ଏବଂ 2% ପ୍ରୋଟିନ୍ ept) ସହିତ ପରିପୂରକ କରାଯାଇଥିଲା। (YPR)] କିମ୍ବା 2% ଗାଲାକ୍ଟୋଜ୍ [YP-ଗାଲାକ୍ଟୋଜ୍ (YPG)] ଏକ କାର୍ବନ ଉତ୍ସ ଭାବରେ, କିମ୍ବା ଏକ ସିନ୍ଥେଟିକ୍ ସର୍ବନିମ୍ନ ମାଧ୍ୟମରେ (0.15% ଇଷ୍ଟ୍ ନାଇଟ୍ରୋଜେନ୍ ଆଧାର ଏବଂ 0.5% ଆମୋନିୟମ୍ ସଲଫେଟ୍) ପୋଷଣ ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ ଉପଯୁକ୍ତ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ଏବଂ କ୍ଷାରକୁ ପରିପୂରକ କରିବା ପାଇଁ, ଏବଂ 2% ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ (କୃତ୍ରିମ ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ସର୍ବନିମ୍ନ ମାଧ୍ୟମ) କିମ୍ବା 2% ଗାଲାକ୍ଟୋଜ୍ (କୃତ୍ରିମ ଗାଲାକ୍ଟୋଜ୍ ସର୍ବନିମ୍ନ ମାଧ୍ୟମ) କାର୍ବନ ଉତ୍ସ ଭାବରେ ଧାରଣ କରାଯାଇଥିଲା।
ପ୍ରକୃତ-ସମୟ ଇମେଜିଂ ପାଇଁ, GAL1 ପ୍ରମୋଟର ଅଧୀନରେ ଗଠନ ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା ତାପମାତ୍ରା-ସମ୍ବେଦନଶୀଳ sec31-1 ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ରାତିସାରା 24°C ରେ YPR ମାଧ୍ୟମରେ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା | 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 24°C ରେ YPG ରେ ଇଣ୍ଡକ୍ସନ ପରେ, କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ SG ରେ 37°C ରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା'ପରେ କ୍ଷରଣ ବ୍ଲକରୁ ମୁକ୍ତ ହେବା ପାଇଁ 24°C କୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ କରାଯାଇଥିଲା | ଏକ କାଚ ସ୍ଲାଇଡରେ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ସ୍ଥିର କରିବା ପାଇଁ Concanavalin A ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ SCLIM ଦ୍ୱାରା ପ୍ରତିଛବି କରାଯାଇଥିଲା | SCLIM ହେଉଛି Olympus IX-71 ଇନଭର୍ଟେଡ୍ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ ଏବଂ UPlanSApo 100×1.4 ସଂଖ୍ୟାତ୍ମକ ଆପେର୍ଚର ତେଲ ଲେନ୍ସ (Olympus), ଉଚ୍ଚ-ଗତି ଏବଂ ଉଚ୍ଚ-ସିଗନାଲ-ଟୁ-ଶବ୍ଦ ଅନୁପାତ ଘୂର୍ଣ୍ଣନ ଡିସ୍କ କନଫୋକାଲ୍ ସ୍କାନର (Yokogawa Electric), କଷ୍ଟମ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟର ଏବଂ କଷ୍ଟମ୍ କୁଲିଂର ଏକ ମିଶ୍ରଣ। ସିଷ୍ଟମର ଇମେଜ୍ ଇଣ୍ଟେନ୍ସଫାୟର୍ (Hamamatsu Photonics) ×266.7 ର ଅନ୍ତିମ ବିବୃତ୍ତକରଣ ସହିତ ଏକ ବିବୃତ୍ତକରଣ ଲେନ୍ସ ସିଷ୍ଟମ ଏବଂ ଇଲେକ୍ଟ୍ରନଗୁଡ଼ିକୁ ଗୁଣନ କରୁଥିବା ଏକ ଚାର୍ଜ-କପଲ୍ଡ ଡିଭାଇସ୍ କ୍ୟାମେରା (21) ପ୍ରଦାନ କରିପାରିବ। ପ୍ରତିଛବି ଅଧିଗ୍ରହଣ କଷ୍ଟମ୍ ସଫ୍ଟୱେର୍ (Yokogawa Electric) ଦ୍ୱାରା କରାଯାଏ। 3D ପ୍ରତିଛବି ପାଇଁ, ଆମେ ଅବଜେକ୍ଟିଭ୍ ଲେନ୍ସକୁ ଭୂଲମ୍ବ ଭାବରେ କମ୍ପନ କରିବା ପାଇଁ ଏକ କଷ୍ଟମ୍-ନିର୍ମିତ ପାଇଜୋଇଲେକ୍ଟ୍ରିକ୍ ଆକ୍ଟୁଏଟର୍ ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ, ଏବଂ ଅପ୍ଟିକାଲ୍ ଅଂଶଗୁଡ଼ିକୁ ଏକ ଷ୍ଟାକରେ 100 nm ଦୂରରେ ସଂଗ୍ରହ କରିଥିଲୁ। Z-ଷ୍ଟାକ୍ ପ୍ରତିଛବିକୁ 3D ଭୋକ୍ସେଲ ଡାଟାରେ ରୂପାନ୍ତରିତ କରାଯାଏ, ଏବଂ ଘୂର୍ଣ୍ଣନ ଡିସ୍କ କନଫୋକାଲ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ତତ୍ତ୍ୱିକ ପଏଣ୍ଟ ସ୍ପ୍ରେଡ୍ ଫଙ୍କସନ୍ ଭୋଲୋସିଟି ସଫ୍ଟୱେର୍ (PerkinElmer) ଦ୍ୱାରା ଡିକନଭୋଲ୍ୟୁସନ୍ ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ। ସହ-ସ୍ଥାନ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ସ୍ୱୟଂଚାଳିତ ଭାବରେ ଥ୍ରେସହୋଲ୍ଡ ପାଇଁ ଭୋଲୋସିଟି ସଫ୍ଟୱେର୍ ବ୍ୟବହାର କରି, କାର୍ଗୋ ସମେତ ERES ମାପ କରାଯାଇଥିଲା। ମେଟାମୋର୍ଫ ସଫ୍ଟୱେର୍ (ଆଣବିକ ଡିଭାଇସ୍) ବ୍ୟବହାର କରି ଲାଇନ ସ୍କାନ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା।
ପରିସଂଖ୍ୟାନଗତ ଗୁରୁତ୍ୱ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବା ପାଇଁ ଗ୍ରାଫପ୍ୟାଡ୍ ପ୍ରିଜମ୍ ସଫ୍ଟୱେର୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ଦୁଇ-ଲାଞ୍ଜ ବିଶିଷ୍ଟ ଛାତ୍ରଙ୍କ ଟି-ପରୀକ୍ଷା ଏବଂ ସାଧାରଣ ଏକ-ପାଖ ବିଶ୍ଳେଷଣର ଭିନ୍ନତା (ANOVA) ପରୀକ୍ଷା ପାଇଁ, ଗୋଷ୍ଠୀ ମଧ୍ୟରେ ପାର୍ଥକ୍ୟକୁ P <0.05 (*) ଉପରେ ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପ୍ରଭାବ ପକାଇବା ଭାବରେ ବିବେଚନା କରାଯାଏ।
Gas1-GFP ର ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ପାଇଁ, ଲଗ୍ ପର୍ଯ୍ୟାୟ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ YPD ରେ ରାତାରାତି ବଢାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା, ଫସଫେଟ୍ ବଫର୍ ସାଲାଇନ୍ ସହିତ ଦୁଇଥର ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ଅତି କମରେ 15 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ବରଫରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା'ପରେ ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ ପରି ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ ତଳେ ଚାଲିଥିଲା ​​ଯାଞ୍ଚ କରନ୍ତୁ (24)। ଅଧିଗ୍ରହଣ ପାଇଁ ଏକ ଅବଜେକ୍ଟିଭ୍ ଲେନ୍ସ, L5 (GFP) ଫିଲ୍ଟର, ହାମାମାତ୍ସୁ କ୍ୟାମେରା ଏବଂ ଆପ୍ଲିକେସନ୍ ସୁଟ୍ X (LAS X) ସଫ୍ଟୱେର୍ ସହିତ ସଜ୍ଜିତ Leica DMi8 ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ (HCX PL APO 1003/1.40 ତେଲ PH3 CS) ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା।
ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ 65°C ତାପମାତ୍ରାରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ SDS ନମୁନା ବଫର ସହିତ ଡିନେଚର କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା’ପରେ SDS-ପଲିଆକ୍ରିଲାମାଇଡ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ (PAGE) ଦ୍ୱାରା ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା। ଇମ୍ୟୁନୋବ୍ଲୋଟିଂ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ, ପ୍ରତି ଲେନ୍ ପାଇଁ 10 μl ନମୁନା ଲୋଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରାଥମିକ ଆଣ୍ଟିବଡି: 1:3000 ଡାଇଲ୍ୟୁସନ୍ ରେ ରେବିଟ୍ ପଲିକ୍ଲୋନାଲ୍ ଆଣ୍ଟି-ଗାସ୍1, 1:500 ଡାଇଲ୍ୟୁସନ୍ ରେ ରେବିଟ୍ ପଲିକ୍ଲୋନାଲ୍ ଆଣ୍ଟି-ଏମ୍ପି24 ଏବଂ 1:3000 ଡାଇଲ୍ୟୁସନ୍ ରେ ରେବିଟ୍ ପଲିକ୍ଲୋନାଲ୍ ଆଣ୍ଟି-GFP (H. Riezman ଙ୍କ ଠାରୁ ଏକ ଉପହାର) ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ମାଉସ୍ ମୋନୋକ୍ଲୋନାଲ୍ ଆଣ୍ଟି-Pgk1 ଆଣ୍ଟିବଡି 1:5000 ଡାଇଲ୍ୟୁସନ୍ ରେ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା (J. de la Cruz ଙ୍କ ଠାରୁ ଏକ ଉପହାର)। ଦ୍ୱିତୀୟ ଆଣ୍ଟିବଡି: ହର୍ସରାଡିଶ୍ ପେରୋକ୍ସିଡେଜ୍ (HRP) କଞ୍ଜୁଗେଟେଡ୍ ଛେଳି ଆଣ୍ଟି-ଖରଜ ଇମ୍ୟୁନୋଗ୍ଲୋବୁଲିନ୍ G (IgG) 1:3000 ଡାଇଲ୍ୟୁସନ୍ ରେ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା (Pierce)। HRP-ସଂଯୁକ୍ତ ଛେଳି ମୂଷା ବିରୋଧୀ IgG 1:3000 (ପିଅର୍ସ) ର ଡାଇଲ୍ୟୁସନ୍ ରେ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। ସୁପରସିଗନାଲ ୱେଷ୍ଟ ପିକୋ ରିଏଜେଣ୍ଟ (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ର କେମିଲୁମିନେସେନ୍ସ ପଦ୍ଧତି ଦ୍ୱାରା ପ୍ରତିରକ୍ଷା ପ୍ରତିକ୍ରିୟା କ୍ଷେତ୍ର ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା।
(31) ରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ଅନୁସାରେ, ସମୃଦ୍ଧ ER ଭଗ୍ନାଂଶ ଉପରେ ଏକ ପ୍ରାକୃତିକ ଇମ୍ୟୁନୋପ୍ରେସିପିଟେସନ୍ ପରୀକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ସଂକ୍ଷେପରେ, TNE ବଫର [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM ଫିନାଇଲ୍ମିଥାଇଲ୍ସଲଫୋନିଲ୍ ଫ୍ଲୋରାଇଡ୍ ଏବଂ ପ୍ରୋଟିଜ୍ ଇନହିବିଟର୍ ମିଶ୍ରଣ) ସହିତ 100 ଅପ୍ଟିକାଲ୍ ଘନତାରେ ଦୁଇଥର 600 nm (OD600) ରେ ୟିଷ୍ଟ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ଧୋଇ ଦିଅନ୍ତୁ। ଏହାକୁ କାଚ ମଣି ସହିତ ଭାଙ୍ଗି ଦିଆଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତାପରେ କୋଷର ଅବଶେଷ ଏବଂ କାଚ ମଣିଗୁଡ଼ିକୁ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ଅପସାରିତ କରାଯାଇଥିଲା। ତାପରେ ସୁପରନାଟାଣ୍ଟକୁ 4°C ରେ 15 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 17,000 ଗ୍ରାମ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ପେଲେଟ୍ କୁ TNE ରେ ପୁନଃସ୍ଥାପିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଡିଜିଟାଲିସ୍ ସାପୋନିନ୍ 1% ର ଅନ୍ତିମ ସାନ୍ଦ୍ରତାରେ ଯୋଡା ଯାଇଥିଲା। ସସପେନ୍ସନ୍ 4°C ରେ ଘୂର୍ଣ୍ଣନ ସହିତ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତାପରେ ଅଦ୍ରବଣୀୟ ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକୁ 13,000 ଗ୍ରାମ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗେସନ୍ ଦ୍ୱାରା 60 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଅପସାରିତ କରାଯାଇଥିଲା। Gas1-GFP ଇମ୍ୟୁନୋପ୍ରେସିପିଟେସନ୍ ପାଇଁ, ପ୍ରଥମେ ନମୁନାକୁ 4°C ତାପମାତ୍ରାରେ ଖାଲି ଆଗାରୋଜ୍ ବିଡ୍ (ChromoTek) ସହିତ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ପୂର୍ବରୁ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ, ଏବଂ ତାପରେ GFP-Trap_A (ChromoTek) ସହିତ 4°C ତାପମାତ୍ରାରେ 3 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ। ଇମ୍ୟୁନୋପ୍ରେସିପିଟେଡ୍ ବିଡ୍ଗୁଡ଼ିକୁ 0.2% ଡିଗୋକ୍ସିଜେନିନ୍ ଯୁକ୍ତ TNE ସହିତ ପାଞ୍ଚ ଥର ଧୋଇ, SDS ନମୁନା ବଫର ସହିତ ଏଲୁଟେଡ୍, SDS-PAGE ରେ ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ଇମ୍ୟୁନୋବ୍ଲୋଟିଂ ଦ୍ୱାରା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା।
(31) ରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ଅନୁସାରେ, ସମୃଦ୍ଧ ER ଭଗ୍ନାଂଶ ଉପରେ କ୍ରସ୍-ଲିଙ୍କିଂ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା। ସଂକ୍ଷେପରେ, ସମୃଦ୍ଧ ER ଭଗ୍ନାଂଶକୁ 0.5 mM dithiobis(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min) ସହିତ ଇନକ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ଗ୍ଲାଇସିନ୍ (50 mM ଚୂଡ଼ାନ୍ତ ସାନ୍ଦ୍ରତା, 5 min, 20°C) ଯୋଡି କ୍ରସ୍ଲିଙ୍କିଂ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାକୁ ନିବାରଣ କରାଯାଇଥିଲା।
ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ (50), ୱାଇଲ୍ଡ-ଟାଇପ୍ ଏବଂ GhLag1 ଷ୍ଟ୍ରେନରେ ସେରାମାଇଡର MS ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ସଂକ୍ଷେପରେ, କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ YPD ରେ 30°C ରେ ଘାତକ ପର୍ଯ୍ୟାୟ (3 ରୁ 4 OD600 ୟୁନିଟ୍ / ମିଲି) ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ 25×107 କୋଷ ଅମଳ କରାଯାଇଥିଲା। ସେମାନଙ୍କର ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ ଟ୍ରାଇକ୍ଲୋରୋଆସେଟିକ୍ ଏସିଡ୍ ସହିତ ନିବାରଣ କରାଯାଏ। ନିଷ୍କାସନ ଦ୍ରାବକ [ଇଥାନଲ୍, ପାଣି, ଇଥର, ପାଇରିଡିନ୍ ଏବଂ 4.2 N ଆମୋନିୟମ୍ ହାଇଡ୍ରୋକ୍ସାଇଡ୍ (15:15:5:1:0.018 v/v)] ଏବଂ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ମାନକ C17 ସେରାମାଇଡ୍ (860517, ଅବନ୍ତି ପୋଲାର ଲିପିଡ୍) ଗୁଣବତ୍ତାର 1.2 nmol ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ନିଷ୍କାସନର ହାଲୁକା କ୍ଷାରୀୟ ଜଳବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବା ପାଇଁ ମୋନୋମେଥାନଲ୍, ପାଣି, n-ବୁଟାନୋଲ୍ ଏବଂ ମିଥାଇଲାମାଇନ୍ ଦ୍ରବଣ (4:3:1:5 v/v)] ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ, ଏବଂ ତା’ପରେ ଡିସଲ୍ଟ କରିବା ପାଇଁ ଜଳ-ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ n-ବୁଟାନୋଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ଶେଷରେ, ନିର୍ଗମକୁ ଏକ ସକାରାତ୍ମକ ମୋଡ୍ ଦ୍ରାବକ [କ୍ଲୋରୋଫର୍ମ/ମିଥାନଲ୍/ଜଳ (2:7:1) + 5 mM ଆମୋନିୟମ୍ ଆସେଟେଟ୍] ରେ ପୁନଃସ୍ଥାପିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟରରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ସ୍ଫିଙ୍ଗୋଲିପିଡ୍ ଅଣୁଗୁଡ଼ିକର ଚିହ୍ନଟ ଏବଂ ପରିମାଣ ପାଇଁ ମଲ୍ଟି-ରିଆକ୍ସନ୍ ମନିଟରିଂ (MRM) କରାଯାଇଥିଲା। TSQ ଭାଣ୍ଟେଜ୍ ଟର୍ସିଆରୀ କ୍ୱାଡ୍ରୁପୋଲ୍ ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟର (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ଲିପିଡ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ଏକ ରୋବୋଟିକ୍ ନାନୋଫ୍ଲୋ ଆୟନ୍ ସୋର୍ସ ନାନୋମେଟ୍ HD (ଆଡଭିଅନ୍ ବାୟୋସାଇନ୍ସ, ଇଥାକା, NY) ସହିତ ସଜ୍ଜିତ। ପ୍ରତ୍ୟେକ ସେରାମାଇଡ୍ ବର୍ଗ ପାଇଁ ଟକ୍କର ଶକ୍ତିକୁ ଅପ୍ଟିମାଇଜ୍ କରାଯାଇଛି। MS ତଥ୍ୟ ସକାରାତ୍ମକ ମୋଡ୍ ରେ ପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇଥିଲା। ପ୍ରତ୍ୟେକ ଜୈବିକ ପ୍ରତିକୃତି ପାଇଁ, ଲିପିଡ୍ ସିଗନାଲ ହେଉଛି ତିନୋଟି ସ୍ୱାଧୀନ ମାପର ମଧ୍ୟମା।
(31) ରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ହୋଇଥିବା ପରି, Gas1-GFP ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା କୋଷଗୁଡ଼ିକ (800×107) ପ୍ରାକୃତିକ ଇମ୍ୟୁନୋପ୍ରେସିପିଟେସନର ଶିକାର ହୋଇଥିଲେ। ପରିଷ୍କୃତ Gas1-GFP କୁ SDS-PAGE ଦ୍ୱାରା ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏକ ପଲିଭିନାଇଲିଡିନ୍ ଫ୍ଲୋରାଇଡ୍ (PVDF) ପରଦାକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରୋଟିନକୁ PVDF କୁ ଆମାଇଡ୍ କଳା ରଙ୍ଗ ଦେଇ ଦୃଶ୍ୟମାନ କରାଯାଇଥିଲା। Gas1-GFP ବ୍ୟାଣ୍ଡକୁ PVDF ରୁ କାଟି ମିଥାନଲ୍ ସହିତ 5 ଥର ଏବଂ ଥରେ ତରଳ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫି-MS (LC-MS) ଗ୍ରେଡ୍ ପାଣି ସହିତ ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା। ପରଦା ଷ୍ଟ୍ରିପ୍ କୁ 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), ବଫର ଏବଂ 500μl ସଦ୍ୟ ଦ୍ରବୀଭୂତ 1 M ସୋଡିୟମ୍ ନାଇଟ୍ରାଇଟ୍ ମିଶ୍ରଣ ସହିତ 3 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରି, ଲିପିଡ୍ ଭଗ୍ନାଂଶ Gas1-GFP ରୁ ମୁକ୍ତ ହୁଏ ଏବଂ ଗ୍ଲୁକୋସାମାଇନ୍ ଏବଂ ଇନୋସିଟୋଲ୍ (51) ମଧ୍ୟରେ ଇନୋସାଇନ୍ ଫସଫେଟ୍ ସେରାମାଇଡ୍ ମୁକ୍ତ ହୁଏ। ଏହା ପରେ, ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ଷ୍ଟ୍ରିପ୍‌କୁ LC-MS ଗ୍ରେଡ୍ ପାଣିରେ ଚାରିଥର ଧୋଇ, କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ଶୁଖାଗଲା, ଏବଂ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ -80°C ରେ ନାଇଟ୍ରୋଜେନ୍ ବାୟୁମଣ୍ଡଳରେ ସଂରକ୍ଷଣ କରାଗଲା। ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଭାବରେ, ପ୍ରତ୍ୟେକ ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ PVDF ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ର ଏକ ଖାଲି ନମୁନା ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। Gas1-GFP ରୁ ନିଷ୍କାସିତ ଲିପିଡ୍‌କୁ ବର୍ଣ୍ଣନା କରାଯାଇଥିବା ପରି MS ଦ୍ୱାରା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା (50)। ସଂକ୍ଷେପରେ, GPI-ଲିପିଡ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା PVDF ଷ୍ଟ୍ରିପ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ 75μl ନକାରାତ୍ମକ ଛାଞ୍ଚ ଦ୍ରାବକ [କ୍ଲୋରୋଫର୍ମ/ମିଥାନଲ୍ (1:2) + 5 mM ଆମୋନିୟମ୍ ଆସେଟେଟ୍] ରେ ପୁନଃସ୍ଥାପିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ସ୍ଫିଙ୍ଗୋଲିପିଡ୍ ପ୍ରଜାତି (TSQ ଭାଣ୍ଟେଜ୍) ର ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋସ୍ପ୍ରେ ଆୟନାଇଜେସନ୍ (ESI)-MRM/MS ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାସ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ଏହି କ୍ଷେତ୍ରରେ, MS ତଥ୍ୟ ନକାରାତ୍ମକ ଆୟନ୍ ମୋଡ୍‌ରେ ପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇଥିଲା।
ପୂର୍ବରୁ ଉଲ୍ଲେଖ କରାଯାଇଥିବା ପରି, GPI ଆଙ୍କରର ଲିପିଡ୍ ଅଂଶକୁ [3H]-ଇନୋସିଟଲ୍-ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା GPI-AP (16) ରୁ ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା। ଲିପିଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ଏକ ଦ୍ରାବକ ପ୍ରଣାଳୀ (55:45:10 କ୍ଲୋରୋଫର୍ମ-ମିଥାନଲ୍-0.25% KCl) ବ୍ୟବହାର କରି ପତଳା-ସ୍ତର କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫି ଦ୍ୱାରା ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ FLA-7000 (ଫୁଜିଫିଲ୍ମ) ବ୍ୟବହାର କରି ଭିଜୁଆଲାଇଜେସନ୍ କରାଯାଇଥିଲା।
Gas1-GFP (600×107) ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ TNE ବଫର ସହିତ TNE ବଫର ସହିତ ଦୁଇଥର ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା, ଏବଂ କାଚ ମଣି ସହିତ ଭାଙ୍ଗି ଦିଆଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା’ପରେ କୋଷର ଅବଶେଷ ଏବଂ କାଚ ମଣିକୁ ବାହାର କରିବା ପାଇଁ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ତା’ପରେ ସୁପରନାଟାଣ୍ଟକୁ 4°C ତାପମାତ୍ରାରେ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 17,000 ଗ୍ରାମ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ପେଲେଟ୍‌କୁ TNEରେ ଧୋଇ 1 U PI-PLC (Invitrogen) ସହିତ TNEରେ 0.2% ଡିଜିଟାଲିସ୍ ସାପୋନିନ୍ ସହିତ 37°C ତାପମାତ୍ରାରେ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ଏନଜାଇମ୍ ଚିକିତ୍ସା ପରେ, 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 4°C ତାପମାତ୍ରାରେ 17,000 ଗ୍ରାମ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ପରଦାକୁ ଅପସାରିତ କରାଯାଇଥିଲା। Gas1-GFP ପ୍ରତିରକ୍ଷା ପ୍ରତିରୋଧକ ଶକ୍ତି ପାଇଁ, ସୁପରନାଟାଣ୍ଟକୁ 4°C ତାପମାତ୍ରାରେ GFP-Trap_A (ChromoTek) ସହିତ ରାତାରାତି ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା। SDS-PAGE ଦ୍ୱାରା ପୃଥକ କରାଯାଇଥିବା ପରିଷ୍କୃତ Gas1-GFP କୁମାସି ବ୍ରିଲିଆଣ୍ଟ ନୀଳ ସହିତ ରଙ୍ଗ କରାଯାଇଥିଲା। ଜଳପ୍ରବାହ ଚାରିପାଖରେ ଥିବା ଧୂସର ରଙ୍ଗରୁ Gas1-GFP ଷ୍ଟେନିଂ ବ୍ୟାଣ୍ଡକୁ କାଟି ଦିଆଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା’ପରେ ଆୟୋଡୋଆସେଟାମାଇଡ୍ ସହିତ ଆଲକିଲେସନ୍ ଏବଂ ଡିଥିଓଥ୍ରେଇଟଲ୍ ସହିତ ହ୍ରାସ ପରେ, ଟ୍ରିପ୍ସିନ୍ ସହିତ ଇନ୍-ଜେଲ୍ ପାଚନ କରାଯାଇଥିଲା। GPI-ଗ୍ଲାଇକାନ୍ସ ସହିତ ଟ୍ରିପ୍ଟିକ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଏବଂ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ବାହାର କରି ଶୁଖାଇ ଦିଅନ୍ତୁ। ଶୁଖିଲା ପେପ୍ଟାଇଡ୍ 20 μl ପାଣିରେ ଦ୍ରବୀଭୂତ ହୋଇଥିଲା। LC ରେ ଏକ ଅଂଶ (8μl) ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ କରନ୍ତୁ। ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଗ୍ରାଡିଏଣ୍ଟ ପରିସ୍ଥିତିରେ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ପୃଥକ କରିବା ପାଇଁ ଏକ ଅକ୍ଟାଡେସିଲସିଲେନ୍ (ODS) ସ୍ତମ୍ଭ (ଡେଭେଲୋସିଲ୍ 300ODS-HG-5; ଭିତର ବ୍ୟାସ 150 mm×1.0 mm; ନୋମୁରା କେମିକାଲ୍, ଆଇଚି ପ୍ରିଫେକ୍ଚର, ଜାପାନ) ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। ମୋବାଇଲ୍ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ହେଉଛି ଦ୍ରାବକ A (0.08% ଫର୍ମିକ ଏସିଡ୍) ଏବଂ ଦ୍ରାବକ B (80% ଆସେଟୋନିଟ୍ରାଇଲ୍ ରେ 0.15% ଫର୍ମିକ ଏସିଡ୍)। ଏକ Accela HPLC ସିଷ୍ଟମ (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍, ବୋଷ୍ଟନ, ମାସାଚୁସେଟ୍ସ) ବ୍ୟବହାର କରି ସ୍ତମ୍ଭକୁ ଦ୍ରାବକ A ସହିତ 50 μl min-1 ପ୍ରବାହ ହାରରେ 55 ମିନିଟ୍ ମଧ୍ୟରେ 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଏଲୁଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତାପରେ ଦ୍ରାବକ B ର ସାନ୍ଦ୍ରତା 40% କୁ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା। , ଯୁକ୍ତରାଷ୍ଟ୍ର)। ଏଲୁଏଟ୍ କୁ ନିରନ୍ତର ESI ଆୟନ ଉତ୍ସରେ ପ୍ରବେଶ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ GPI-ଗ୍ଲାଇକାନ ସହିତ ଟ୍ରିପ୍ଟିକ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସ ଏବଂ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସକୁ LTQ ଅର୍ବିଟ୍ରାପ୍ XL (ହାଇବ୍ରିଡ୍ ଲିନିଅର୍ ଆୟନ୍ ଟ୍ରାପ୍-ଅର୍ବିଟ୍ରାପ୍ ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟର୍; ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ଦ୍ୱାରା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। MS ସେଟଅପରେ, କୈଶିକ ଉତ୍ସର ଭୋଲଟେଜ 4.5 kV ରେ ସେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କୈଶିକତାର ତାପମାତ୍ରା 300°C ରେ ରଖାଯାଇଥିଲା। କୈଶିକ ଭୋଲଟେଜ ଏବଂ ଟ୍ୟୁବ୍ ଲେନ୍ସ ଭୋଲଟେଜ ଯଥାକ୍ରମେ 15 V ଏବଂ 50 V ରେ ସେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା। MS ତଥ୍ୟ 300/m/z ମାଂସ/ଚାର୍ଜ ଅନୁପାତ (m/z) 3000 ର ଏକ ମାଂସ ପରିସର ମଧ୍ୟରେ ସକାରାତ୍ମକ ଆୟନ ମୋଡରେ (60,000 ରିଜୋଲ୍ୟୁସନ; ପ୍ରତି ମିଲିୟନରେ 10 ଅଂଶର ମାଂସ ସଠିକତା) ପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇଥିଲା। MS/MS ତଥ୍ୟ LTQ Orbitrap XL [ପ୍ରଥମ 3 ଅଙ୍କ ଯାହା ଉପରେ ତଥ୍ୟ ନିର୍ଭର କରେ, ଟକ୍କର ପ୍ରେରିତ ବିଚ୍ଛିନ୍ନତା (CID)] ରେ ଆୟନ ଟ୍ରାପ୍ ମାଧ୍ୟମରେ ପ୍ରାପ୍ତ ହୁଏ।
MD ସିମୁଲେସନ୍ GROMACS (52) ସଫ୍ଟୱେର୍ ଏବଂ MARTINI 2 ଫୋର୍ସ ଫିଲ୍ଡ (53-55) ବ୍ୟବହାର କରି କରାଯାଇଥିଲା। ତା'ପରେ CHARMM GUI ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ବିଲ୍ଡର୍ (56, 57) କୁ ଡାୟୋଲିଓଏଲ୍ଫସ୍ଫାଟିଡିଲକୋଲାଇନ୍ (DOPC) ଏବଂ Cer C18 କିମ୍ବା DOPC ଏବଂ Cer C26 ଧାରଣ କରିଥିବା ଏକ ବାଇଲେୟର ନିର୍ମାଣ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। Cer C26 ର ଟୋପୋଲୋଜି ଏବଂ କୋଅର୍ଡିନେଟ୍ ସ୍ଫିଙ୍ଗୋସାଇନ୍ ଟେଲ୍ ରୁ ଅତିରିକ୍ତ ମଣିକୁ ଅପସାରଣ କରି DXCE ରୁ ପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇଛି। ଡବଲ୍ ସ୍ତରକୁ ସନ୍ତୁଳିତ କରିବା ଏବଂ ଏହାକୁ ଚଲାଇବା ପାଇଁ ନିମ୍ନରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ପ୍ରକ୍ରିୟା ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ, ତା'ପରେ Emp24 ଧାରଣ କରିଥିବା ଏକ ସିଷ୍ଟମ୍ ନିର୍ମାଣ କରିବା ପାଇଁ ସିଷ୍ଟମର ଶେଷ କୋଅର୍ଡିନେଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ଈଷ୍ଟ Emp24 (ଅବଶେଷ 173 ରୁ 193) ର ଟ୍ରାନ୍ସମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ଡୋମେନ୍ ଭିଜୁଆଲ୍ MD (VMD) ଉପକରଣ ଆଣବିକ ଗଠନ (58) ବ୍ୟବହାର କରି ଏକ α-ହେଲିକ୍ସ ଭାବରେ ନିର୍ମିତ ହୋଇଥିଲା। ତା'ପରେ, ଓଭରଲାପ୍ିଂ ଲିପିଡ୍ ଅପସାରଣ କରିବା ପରେ, ପ୍ରୋଟିନ୍ କୁ ସ୍ଥୁଳ ଭାବରେ ଦାନାଯୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ CHARMM GUI ବ୍ୟବହାର କରି ବାଇଲେୟରରେ ପ୍ରବେଶ କରାଯାଇଥିଲା। ଅନ୍ତିମ ସିଷ୍ଟମରେ 1202 DOPC ଏବଂ 302 Cer C26 କିମ୍ବା 1197 DOPC ଏବଂ 295 Cer C18 ଏବଂ Emp24 ରହିଛି। ସିଷ୍ଟମକୁ 0.150M ସାନ୍ଦ୍ରତାରେ ଆୟନାଇଜ୍ କରନ୍ତୁ। ଦୁଇଟି ବାଇଲେୟର ରଚନା ପାଇଁ ଚାରୋଟି ସ୍ୱାଧୀନ ପ୍ରତିକୃତି ତିଆରି କରାଯାଇଥିଲା।
CHARMM GUI ପ୍ରକ୍ରିୟା ବ୍ୟବହାର କରି ଲିପିଡ୍ ବାଇଲେୟରକୁ ସନ୍ତୁଳିତ କରାଯାଏ, ଯେଉଁଥିରେ 405,000 ପଦକ୍ଷେପକୁ ସର୍ବନିମ୍ନ କରିବା ଏବଂ ତାପରେ ସନ୍ତୁଳିତ କରିବା ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ, ଯେଉଁଠାରେ ସ୍ଥିତି ପ୍ରତିବନ୍ଧକଗୁଡ଼ିକୁ ଧୀରେ ଧୀରେ ହ୍ରାସ ଏବଂ ଦୂର କରାଯାଏ, ଏବଂ ସମୟ ପଦକ୍ଷେପକୁ 0.005 ps ରୁ 0.02 ps କୁ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଏ। ସମତୁଲ୍ୟକରଣ ପରେ, ଏହା 0.02 ps ସମୟ ପଦକ୍ଷେପ ସହିତ 6 µs ଉତ୍ପାଦନ କରେ। Emp24 ପ୍ରବେଶ କରିବା ପରେ, ସିଷ୍ଟମକୁ ସର୍ବନିମ୍ନ ଏବଂ ସନ୍ତୁଳିତ କରିବା ପାଇଁ ସମାନ CHARMM GUI ପ୍ରକ୍ରିୟା ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ, ଏବଂ ତାପରେ ଉତ୍ପାଦନରେ 8 ସେକେଣ୍ଡ ପାଇଁ ଚଲାନ୍ତୁ।
ସମସ୍ତ ସିଷ୍ଟମ ପାଇଁ, ସନ୍ତୁଳନ ପ୍ରକ୍ରିୟା ସମୟରେ, ଚାପ ବେରେଣ୍ଡସେନ୍ ବାରୋଷ୍ଟାଟ୍ (59) ଦ୍ୱାରା ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ହୁଏ, ଏବଂ ଉତ୍ପାଦନ ପ୍ରକ୍ରିୟା ସମୟରେ, ଚାପ ପାରିନେଲୋ-ରହମାନ ବାରୋଷ୍ଟାଟ୍ (60) ଦ୍ୱାରା ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ହୁଏ। ସମସ୍ତ କ୍ଷେତ୍ରରେ, ହାରାହାରି ଚାପ 1 ବାର୍ ଏବଂ ଏକ ଅର୍ଦ୍ଧ-ଆଇସୋଟ୍ରୋପିକ୍ ଚାପ ଯୁଗଳ ଯୋଜନା ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ। ସନ୍ତୁଳନ ଏବଂ ଉତ୍ପାଦନ ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ, ପ୍ରୋଟିନ୍, ଲିପିଡ୍ ଏବଂ ଦ୍ରାବକ କଣିକାଗୁଡ଼ିକର ତାପମାତ୍ରା ଯଥାକ୍ରମେ ଯୋଡାଇବା ପାଇଁ ଗତି ପୁନର୍ମାଣ ସହିତ ଏକ ଥର୍ମୋଷ୍ଟାଟ୍ (61) ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ। ସମଗ୍ର କାର୍ଯ୍ୟ ସମୟରେ, ଲକ୍ଷ୍ୟ ତାପମାତ୍ରା 310K। 0.005 ବଫର ସହନଶୀଳତା ସହିତ Verlet ଯୋଜନା ବ୍ୟବହାର କରି ଏକ ଯୋଡି ତାଲିକା ସୃଷ୍ଟି କରି ଅଣ-ବନ୍ଧନ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ଗଣନା କରାଯାଏ। Coulomb ଶବ୍ଦଟି ପ୍ରତିକ୍ରିୟା କ୍ଷେତ୍ର ଏବଂ 1.1 nm ର ଏକ କଟ୍-ଅଫ୍ ଦୂରତା ବ୍ୟବହାର କରି ଗଣନା କରାଯାଏ। Vander Waals ଶବ୍ଦଟି 1.1 nm ର ଏକ କଟ୍-ଅଫ୍ ଦୂରତା ସହିତ ଏକ କଟ୍-ଅଫ୍ ଯୋଜନା ବ୍ୟବହାର କରେ, ଏବଂ Verlet କଟ୍-ଅଫ୍ ଯୋଜନା ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଡ୍ରିଫ୍ଟ (62) ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ।
VMD ବ୍ୟବହାର କରି, DOPC ଫସଫେଟ୍ ବିଡ୍ କିମ୍ବା ସେରାମାଇଡ୍ AM1 ବିଡ୍ ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ମଧ୍ୟରେ କଟଅଫ୍ ତରଙ୍ଗଦୈର୍ଘ୍ୟ 0.7 nm, ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସହିତ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା କରୁଥିବା ଲିପିଡ୍ ସଂଖ୍ୟା ଗଣନା କରାଯାଏ। ନିମ୍ନଲିଖିତ ସୂତ୍ର ଅନୁସାରେ, (63) ରେ ଦର୍ଶାଯାଇଥିବା ପରି ହ୍ରାସ-ସୃଦ୍ଧି (DE) କାରକ ଗଣନା କରନ୍ତୁ: DE କାରକ = (ପ୍ରୋଟିନ୍ 0.7 ରେ ମୋଟ ଲିପିଡ୍ ପରିମାଣ) ପ୍ରୋଟିନ୍ 0.7 ରେ (ମୋଟ ଲିପିଡ୍ ରେ Cer ପରିମାଣ)
ରିପୋର୍ଟ କରାଯାଇଥିବା ମୂଲ୍ୟ ହାରାହାରି ଭାବରେ ପ୍ରାପ୍ତ ହୁଏ, ଏବଂ ତ୍ରୁଟି ବାର୍ ଗୁଡିକ SE ର ଚାରୋଟି ସ୍ୱାଧୀନ କପି ଅଟେ। DE କାରକର ପରିସଂଖ୍ୟାନଗତ ଗୁରୁତ୍ୱ t ପରୀକ୍ଷା [(averageDE-factor-1)/SE] ଦ୍ୱାରା ଗଣନା କରାଯାଏ। ଏକ-ଲାଞ୍ଜ ବଣ୍ଟନରୁ P ମୂଲ୍ୟ ଗଣନା କରନ୍ତୁ।
ଟ୍ରେସର ଶେଷ 250 ns ମଧ୍ୟରେ Emp24 ଧାରଣ କରିଥିବା ସିଷ୍ଟମର 2D ପାର୍ଶ୍ଵିକ ଘନତା ମାନଚିତ୍ର ଗଣନା କରିବା ପାଇଁ GROMACS ଉପକରଣ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। ସେରାମାଇଡର ସମୃଦ୍ଧି/ଅବକ୍ଷୟ ମାନଚିତ୍ର ପାଇବା ପାଇଁ, Cerର ଘନତା ମାନଚିତ୍ରକୁ Cer ଏବଂ DOPC ମାନଚିତ୍ରର ଯୋଗଫଳ ଦ୍ୱାରା ବିଭକ୍ତ କରାଯାଏ, ଏବଂ ତା'ପରେ ଶରୀରରେ Cerର ଘନତା ଦ୍ୱାରା ବିଭକ୍ତ କରାଯାଏ। ସମାନ ରଙ୍ଗ ମାନଚିତ୍ର ସ୍କେଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ।
ଏହି ଆର୍ଟିକିଲର ପରିପୂରକ ସାମଗ୍ରୀ ପାଇଁ, ଦୟାକରି http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 ଦେଖନ୍ତୁ।
ଏହା ଏକ ଖୋଲା ପ୍ରବେଶ ପ୍ରବନ୍ଧ ଯାହା କ୍ରିଏଟିଭ୍ କମନ୍ସ ଆଟ୍ରିବ୍ୟୁସନ୍-ଅଣ-ବାଣିଜ୍ୟିକ ଲାଇସେନ୍ସର ନିୟମାବଳୀ ଅଧୀନରେ ବଣ୍ଟନ କରାଯାଇଛି, ଯାହା ଯେକୌଣସି ମାଧ୍ୟମରେ ବ୍ୟବହାର, ବଣ୍ଟନ ଏବଂ ପୁନରୁତ୍ପାଦନକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ, ଯଦି ଶେଷ ବ୍ୟବହାର ବାଣିଜ୍ୟିକ ଲାଭ ପାଇଁ ନୁହେଁ ଏବଂ ମୂଳ କାର୍ଯ୍ୟ ସଠିକ୍ ବୋଲି ଆଧାରିତ। ସନ୍ଦର୍ଭ।
ଟିପ୍ପଣୀ: ଆମେ କେବଳ ଆପଣଙ୍କୁ ଆପଣଙ୍କର ଇମେଲ୍ ଠିକଣା ପ୍ରଦାନ କରିବାକୁ କହୁଛୁ ଯାହା ଦ୍ଵାରା ଆପଣ ପୃଷ୍ଠାକୁ ସୁପାରିଶ କରୁଥିବା ବ୍ୟକ୍ତି ଜାଣିପାରିବେ ଯେ ଆପଣ ତାଙ୍କୁ ଇମେଲ୍ ଦେଖିବାକୁ ଚାହୁଁଛନ୍ତି ଏବଂ ଏହା ସ୍ପାମ୍ ନୁହେଁ। ଆମେ କୌଣସି ଇମେଲ୍ ଠିକଣା କ୍ୟାପଚର କରିବୁ ନାହିଁ।
ଏହି ପ୍ରଶ୍ନଟି ଆପଣ ଜଣେ ପରିଦର୍ଶକ କି ନାହିଁ ତାହା ପରୀକ୍ଷା କରିବା ଏବଂ ସ୍ୱୟଂଚାଳିତ ସ୍ପାମ୍ ଦାଖଲକୁ ରୋକିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ।
ସୋଫିଆ ରୋଡ୍ରିଗେଜ୍-ଗାଲାର୍ଡୋ, କାଜୁଓ କୁରୋକାୱା, ସୁଜାନା ସାବିଡୋ-ବୋଜୋ, ଆଲେଜାଣ୍ଡ୍ରୋ କର୍ଟେଜ୍ · ଗୋମେଜ୍ (ଆଲେଜାଣ୍ଡ୍ରୋ କର୍ଟେସ୍-ଗୋମେଜ୍), ଆଟସୁକୋ ଇକେଡା (ଆଟସୁକୋ ଇକେଡା), ଭାଲେରିଆ ଜୋନି (ଭାଲେରିଆ ଜୋନି), ଆକ୍ସିଲିଡୋରା ଆଗୁଏଲେରା-ରୋମେରୋ, ସେରେନା ଲୋପେଜ୍), ମିହୋ ୱାଗା (ମିହୋ ୱାଗା), ମିସାକୋ ଅରମାନ (ମିସାକୋ ଆରମାନ), ମିଆକୋ ରିମାନ (ମିଆକୋ ରିମାନ), ପ୍ରୋ ଆକିରା, ଷ୍ଟେଫାନୋ ଫନି, ଆକିହିକୋ ନାକାନୋ, ମାନୁଏଲ ମୁନିଜ
3D ଉଚ୍ଚ-ରିଜୋଲ୍ୟୁସନ୍ ରିଅଲ୍-ଟାଇମ୍ ଇମେଜିଂ ଚୟନିତ ଆଉଟପୁଟ୍ ସାଇଟ୍‌ଗୁଡ଼ିକରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସଜାଡ଼ିବା ପାଇଁ ସେରାମାଇଡ୍ ଚେନ୍ ଲମ୍ବକୁ ଗୁରୁତ୍ୱ ଦିଏ।
ସୋଫିଆ ରୋଡ୍ରିଗେଜ୍-ଗାଲାର୍ଡୋ, କାଜୁଓ କୁରୋକାୱା, ସୁଜାନା ସାବିଡୋ-ବୋଜୋ, ଆଲେଜାଣ୍ଡ୍ରୋ କର୍ଟେଜ୍ · ଗୋମେଜ୍ (ଆଲେଜାଣ୍ଡ୍ରୋ କର୍ଟେସ୍-ଗୋମେଜ୍), ଆଟସୁକୋ ଇକେଡା (ଆଟସୁକୋ ଇକେଡା), ଭାଲେରିଆ ଜୋନି (ଭାଲେରିଆ ଜୋନି), ଆକ୍ସିଲିଡୋରା ଆଗୁଏଲେରା-ରୋମେରୋ, ସେରେନା ଲୋପେଜ୍), ମିହୋ ୱାଗା (ମିହୋ ୱାଗା), ମିସାକୋ ଅରମାନ (ମିସାକୋ ଆରମାନ), ମିଆକୋ ରିମାନ (ମିଆକୋ ରିମାନ), ପ୍ରୋ ଆକିରା, ଷ୍ଟେଫାନୋ ଫନି, ଆକିହିକୋ ନାକାନୋ, ମାନୁଏଲ ମୁନିଜ
3D ଉଚ୍ଚ-ରିଜୋଲ୍ୟୁସନ୍ ରିଅଲ୍-ଟାଇମ୍ ଇମେଜିଂ ଚୟନିତ ଆଉଟପୁଟ୍ ସାଇଟ୍‌ଗୁଡ଼ିକରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସଜାଡ଼ିବା ପାଇଁ ସେରାମାଇଡ୍ ଚେନ୍ ଲମ୍ବକୁ ଗୁରୁତ୍ୱ ଦିଏ।
© 2020 ବିଜ୍ଞାନର ଉନ୍ନତି ପାଇଁ ଆମେରିକୀୟ ଆସୋସିଏସନ୍ | ସମସ୍ତ ଅଧିକାର ସଂରକ୍ଷିତ | AAAS ହେଉଛି HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ଏବଂ COUNTER ର ଅଂଶୀଦାର | ସାଇନ୍ସ ଆଡଭାନ୍ସ ISSN 2375-2548 |