Nature.com ପରିଦର୍ଶନ କରିବା ପାଇଁ ଆପଣଙ୍କୁ ଧନ୍ୟବାଦ। ଆପଣ ବ୍ୟବହାର କରୁଥିବା ବ୍ରାଉଜର ସଂସ୍କରଣରେ CSS ପାଇଁ ସୀମିତ ସମର୍ଥନ ଅଛି। ସର୍ବୋତ୍ତମ ଅଭିଜ୍ଞତା ପାଇଁ, ଆମେ ଆପଣଙ୍କୁ ଏକ ଅପଡେଟ୍ ବ୍ରାଉଜର୍ ବ୍ୟବହାର କରିବାକୁ ସୁପାରିଶ କରୁଛୁ (କିମ୍ବା ଇଣ୍ଟରନେଟ୍ ଏକ୍ସପ୍ଲୋରରରେ ସୁସଙ୍ଗତତା ମୋଡ୍ ବନ୍ଦ କରନ୍ତୁ)। ଏହି ସମୟ ମଧ୍ୟରେ, ନିରନ୍ତର ସମର୍ଥନ ସୁନିଶ୍ଚିତ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ସାଇଟ୍‌କୁ ଷ୍ଟାଇଲ୍ ଏବଂ JavaScript ବିନା ପ୍ରଦର୍ଶନ କରିବୁ।
ମେରୁଦଣ୍ଡୀ ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କ ପରି, କୀଟପତଙ୍ଗମାନଙ୍କର ପୁରୁଷ-ପକ୍ଷବାଦୀ ଯୌନ ଷ୍ଟେରଏଡ୍ ହରମୋନର ଅଭାବ ଥିବା ସାଧାରଣତଃ ବିଶ୍ୱାସ କରାଯାଏ। ଆନୋଫିଲ୍ସ ଗାମ୍ବିୟାରେ, ଏକଡିସୋନ୍ ଷ୍ଟେରଏଡ୍ 20-ହାଇଡ୍ରୋକ୍ସିଏକ୍ଡାଇସୋନ୍ (20E) ମହିଳାମାନଙ୍କ ଦ୍ୱାରା ସଂଶ୍ଳେଷିତ ହେବା ସମୟରେ ଅଣ୍ଡା ବିକାଶକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରିବା ଏବଂ ପୁରୁଷମାନଙ୍କ ଦ୍ୱାରା ଯୌନ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ ହେବା ସମୟରେ ଏକ ମିଳନ ଅପ୍ରତିରୋଧକ ଅବଧିକୁ ପ୍ରେରଣା ଦେବା ପାଇଁ ବିକଶିତ ହୋଇଥିବା ପରି ମନେହୁଏ। ଯେହେତୁ ଅଣ୍ଡା ବିକାଶ ଏବଂ ମିଳନ ହେଉଛି ଅତ୍ୟାବଶ୍ୟକ ପ୍ରଜନନାତ୍ମକ ଗୁଣ, ମହିଳା ଆନୋଫିଲ୍ସ ମଶା କିପରି ଏହି ହରମୋନ ସଙ୍କେତଗୁଡ଼ିକୁ ଏକୀକୃତ କରନ୍ତି ତାହା ବୁଝିବା ନୂତନ ମ୍ୟାଲେରିଆ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ରମର ଡିଜାଇନ୍କୁ ସହଜ କରିପାରିବ। ଏଠାରେ, ଆମେ ପ୍ରକାଶ କରୁଛୁ ଯେ ଏହି ପ୍ରଜନନ କାର୍ଯ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ଏକଡିଷ୍ଟେରଏଡ୍-ସକ୍ରିୟ/ନିଷ୍କ୍ରିୟ ଏନଜାଇମର ଏକ ଜଟିଳ ନେଟୱାର୍କ ମାଧ୍ୟମରେ ସ୍ୱତନ୍ତ୍ର ଯୌନ ଷ୍ଟେରଏଡ୍ ଦ୍ୱାରା ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ହୁଏ। ଆମେ ଏକ ପୁରୁଷ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଅକ୍ସିଡାଇସୋନ୍, 3-ଡିହାଇଡ୍ରୋ-20E (3D20E) ଚିହ୍ନଟ କରିଛୁ, ଯାହା ଯୌନ ସ୍ଥାନାନ୍ତର ଏବଂ ଡିଫସଫୋରିଲେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ସକ୍ରିୟକରଣ ପରେ ମହିଳା ଯୌନ ଗ୍ରହଣଶୀଳତାକୁ ବନ୍ଦ କରି ପିତାମାତାଙ୍କୁ ସୁରକ୍ଷା ଦିଏ। ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ, 3D20E ସ୍ଥାନାନ୍ତର ମଧ୍ୟ ପ୍ରଜନନ ଜିନ୍ ର ପ୍ରକାଶନକୁ ପ୍ରେରଣା ଦେଇଥିଲା ଯାହା ପ୍ଲାଜମୋଡିୟମ୍ ସଂକ୍ରମଣ ସମୟରେ ଅଣ୍ଡା ବିକାଶକୁ ବଜାୟ ରଖେ, ସଂକ୍ରମିତ ମହିଳାମାନଙ୍କ ସ୍ୱାସ୍ଥ୍ୟକୁ ସୁନିଶ୍ଚିତ କରେ। ମହିଳା-ଉତ୍ପନ୍ନ 20E ଯୌନ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସୃଷ୍ଟି କରେ ନାହିଁ, କିନ୍ତୁ 20E-ନିରୋଧକ କାନାସେସ୍ ବାଧାପ୍ରାପ୍ତ ହେବା ପରେ ମିଳନ ବ୍ୟକ୍ତିମାନଙ୍କୁ ଅଣ୍ଡା ଦେବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ। ଏହି ପୁରୁଷ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କୀଟପତଙ୍ଗ ଷ୍ଟେରଏଡ୍ ହରମୋନର ଚିହ୍ନଟ ଏବଂ ମହିଳା ଯୌନ ଗ୍ରହଣଶୀଳତା, ପ୍ରଜନନ କ୍ଷମତା ଏବଂ ପ୍ଲାଜମୋଡିୟମ୍ ସହିତ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟାକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରିବାରେ ଏହାର ଭୂମିକା ମ୍ୟାଲେରିଆ-ପ୍ରଚାରକ ମଶାଙ୍କ ପ୍ରଜନନ ସଫଳତାକୁ ହ୍ରାସ କରିବାର ସମ୍ଭାବନାକୁ ସୂଚାଇ ଦିଏ।
ମାନବ ମ୍ୟାଲେରିଆ ପରଜୀବୀଙ୍କ ଏକମାତ୍ର ବାହକ ଆନୋଫିଲିସ୍ ମଶାଙ୍କ ବ୍ୟାପକ କୀଟନାଶକ ପ୍ରତିରୋଧ ଯୋଗୁଁ ମ୍ୟାଲେରିଆ ମାମଲା ଏବଂ ମୃତ୍ୟୁ ପୁଣିଥରେ ବୃଦ୍ଧି ପାଉଛି। ଏହି ମଶାମାନଙ୍କର ମିଳନ ଜୀବବିଜ୍ଞାନ ନୂତନ ମ୍ୟାଲେରିଆ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ହସ୍ତକ୍ଷେପ ପାଇଁ ଏକ ବିଶେଷ ଆକର୍ଷଣୀୟ ଲକ୍ଷ୍ୟ କାରଣ ମହିଳାମାନେ କେବଳ ଥରେ ମିଳନ କରନ୍ତି; ଏହି ଏକକ ମିଳନ ଘଟଣାକୁ ଜୀବାଣୁମୁକ୍ତ କରିବା ଦ୍ୱାରା କ୍ଷେତ୍ରରେ ମଶା ସଂଖ୍ୟା ହ୍ରାସ କରିବାର ଯଥେଷ୍ଟ ସମ୍ଭାବନା ରହିବ।
ପୁରୁଷମାନଙ୍କଠାରୁ ଉଚ୍ଚ-ଟାଇଟର ଷ୍ଟେରଏଡ୍ ହରମୋନ୍ ଗ୍ରହଣ କରିବା ପରେ ମହିଳାମାନେ ଯୌନ ଅକ୍ଷମ ହୋଇଯାଆନ୍ତି। ଅଧ୍ୟୟନରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ଅଧିକ ମିଳନରେ ଅସୁବିଧାର କାରଣ ହେଉଛି 20-ହାଇଡ୍ରୋକ୍ସିଏକ୍ଡାଇସୋନ୍ (20E), ଏକ ଷ୍ଟେରଏଡ୍ ହରମୋନ୍ ଯାହା ଲାର୍ଭା ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ମଲ୍ଟିଂ ଚକ୍ରର ନିୟନ୍ତ୍ରକ ଭାବରେ ଜଣାଶୁଣା। ପୁରୁଷମାନଙ୍କର 20E ସଂଶ୍ଳେଷଣ ଏବଂ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରିବାର କ୍ଷମତା ବିଶେଷ ଭାବରେ ଆନୋଫିଲିସ୍ ପ୍ରଜାତିରେ ବିକଶିତ ହୋଇଛି ଯାହା ଉପ-ଜେନସ୍ ସେଲିଆ7 ର ଅଂଶ, ଯାହା ଆଫ୍ରିକାରେ ବଣ୍ଟନ କରାଯାଏ ଏବଂ ମ୍ୟାଲେରିଆର ସବୁଠାରୁ ବିପଜ୍ଜନକ ବାହକ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରେ, ଯେଉଁଥିରେ ଆନୋଫିଲିସ୍ ଗାମ୍ବିଆ ମଧ୍ୟ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ। ଏହା ବିଶେଷ ଭାବରେ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ କାରଣ ଏହି ପ୍ରଜାତିରେ ମହିଳାମାନେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ରକ୍ତ ଭୋଜନ ପରେ 20E ଉତ୍ପାଦନ କରନ୍ତି, ଏବଂ 20E ଓଜେନେସିସ୍ ଚକ୍ରକୁ ଚଲାଏ (ସନ୍ଦର୍ଭ 8 ଦେଖନ୍ତୁ)। ତଥାପି, ମହିଳାମାନେ କିପରି ଏକଡିସୋନ୍ (ପୁରୁଷ ସ୍ଥାନାନ୍ତର ଏବଂ ରକ୍ତ ଖାଦ୍ୟ ପ୍ରେରଣା) ର ଦୁଇଟି ଭିନ୍ନ ଉତ୍ସରୁ ସିଗନାଲଗୁଡ଼ିକୁ ଏକୀକୃତ କରନ୍ତି ସେ ବିଷୟରେ ବହୁତ କମ୍ ଜଣାଶୁଣା, ଯାହା ସେମାନଙ୍କ ନିଜସ୍ୱ ମିଳନ କ୍ଷମତାକୁ ଆଘାତ ନକରି ହୁଏ। ପ୍ରକୃତରେ, ଯଦି ମହିଳାମାନଙ୍କ ଦ୍ୱାରା ଉତ୍ପାଦିତ 20E ଯୌନ ଅସହିଷ୍ଣୁତାକୁ ଟ୍ରିଗର କରେ, ତେବେ ଏହା କୁମାରୀ-ଖାଦ୍ୟଦାତା ବ୍ୟକ୍ତିମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ବନ୍ଧ୍ୟାତ୍ୱ ସୃଷ୍ଟି କରିବ, ଏହି ମଶାମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ଏକ ସାଧାରଣ ଆଚରଣ।
ଏକ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ବ୍ୟାଖ୍ୟା ହେଉଛି ଯେ A. gambiae ପୁରୁଷମାନେ ଏକ ପରିବର୍ତ୍ତିତ ପୁରୁଷ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ecdysone ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରନ୍ତି, ଯାହା ମହିଳା ପ୍ରଜନନ ପଥରେ ଏକ ସଙ୍କେତିକ କାସ୍କେଡକୁ ସକ୍ରିୟ କରେ, ଯାହା ଫଳରେ ମିଳନ ଅସ୍ଥିରତା ସୃଷ୍ଟି ହୁଏ। ତଥାପି, ଯଦିଓ ମେରୁଦଣ୍ଡୀ ପ୍ରାଣୀଙ୍କ ପାଖରେ ଏଷ୍ଟ୍ରୋଜେନ ଏବଂ ଆଣ୍ଡ୍ରୋଜେନ (ସନ୍ଦର୍ଭ 9 ରେ ସମୀକ୍ଷା କରାଯାଇଛି) ଭଳି ଏକାଧିକ ଷ୍ଟେରଏଡ ହରମୋନ ଅଛି, ଆମର ଜ୍ଞାନ ଅନୁସାରେ, କୀଟପତଙ୍ଗମାନଙ୍କଠାରେ ଆଣ୍ଡ୍ରୋଜେନିକ-ପକ୍ଷବାଦୀ ଷ୍ଟେରଏଡ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇ ନାହିଁ।
ଆମେ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ପରିବର୍ତ୍ତନକାରୀ ଷ୍ଟେରଏଡ୍ ଖୋଜିବା ପାଇଁ ଯୌନ ପରିପକ୍ୱ A. gambiae ର ପୁରୁଷ ଆକ୍ସେସରି ଗ୍ରନ୍ଥି (MAG) ରେ ଷ୍ଟେରଏଡ୍ ହରମୋନର ସଂଗ୍ରହ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବାକୁ ବାହାରିଥିଲୁ। ପୂର୍ବରୁ ବ୍ୟବହୃତ କମ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପଦ୍ଧତି ପରିବର୍ତ୍ତେ ଟାଣ୍ଡେମ୍ ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି (HPLC-MS/MS) ସହିତ ଯୋଡ଼ି ହୋଇଥିବା ଉଚ୍ଚ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ତରଳ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫି ବ୍ୟବହାର କରି, ଆମେ ଏହି ଟିସୁରେ ecdysone (E) ଏବଂ 20E ଚିହ୍ନଟ କରିଥିଲୁ, ଯାହା ପୂର୍ବ ଫଳାଫଳକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରିଥିଲା। ତଥାପି, ନମୁନାରେ ଅକ୍ସିଡାଇଜ୍ଡ ଫସଫୋରିଲେଟେଡ୍ ଷ୍ଟେରଏଡ୍ ପ୍ରାଧାନ୍ୟ ଥିଲା, ଯାହା ସୂତ୍ର 3-ଡିହାଇଡ୍ରୋ-20E-22-ଫସଫେଟ୍ (3D20E22P)12 (ଚିତ୍ର 1) ସହିତ ସୁସଙ୍ଗତ ଥିଲା। ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ରୂପଗୁଡ଼ିକ ମଧ୍ୟରେ 3-ଡିହାଇଡ୍ରୋ-20E (3D20E) ଏବଂ 20E-22-ଫସଫେଟ୍ (20E22P) ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ। 3D20E22P ର HPLC-MS/MS ସିଗନାଲ ତୀବ୍ରତା ଏହାର ଡିଫସଫୋରିଲେଟେଡ୍ ଫର୍ମ, 3D20E ଅପେକ୍ଷା ଦୁଇ ପରିମାଣ ଅଧିକ ଏବଂ E ଏବଂ 20E ଅପେକ୍ଷା ତିନି ପରିମାଣ ଅଧିକ ଥିଲା (ଚିତ୍ର 1).ଯଦିଓ ଶରୀରର ଅନ୍ୟ ଅଂଶ ଏବଂ ନିମ୍ନ ପ୍ରଜନନ ପଥ (LRT; ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ଚିତ୍ର 1a) ରେ। ଆମେ ନୂତନ ଭାବରେ ବନ୍ଦ (<1 ଦିନ ପୁରୁଣା) ପୁରୁଷ ଏବଂ ମହିଳାମାନଙ୍କରେ ମଧ୍ୟ ଏକଡିଷ୍ଟେରଏଡ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିଥିଲୁ ଏବଂ କେବଳ MAG ରେ 3D20E ଏବଂ 3D20E22P ଚିହ୍ନଟ କରିଥିଲୁ; E, 20E ଏବଂ 20E22P ଉଭୟ ଲିଙ୍ଗରେ ଉପସ୍ଥିତ ଥିଲେ (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ଚିତ୍ର 1b)। ଏହି ତଥ୍ୟ ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ A. gambiae ବୟସ୍କ ପୁରୁଷମାନେ ସେମାନଙ୍କ MAG ରେ ପରିବର୍ତ୍ତନକାରୀ ହରମୋନର ଉଚ୍ଚ ଟାଇଟର ଉତ୍ପାଦନ କରନ୍ତି ଯାହା ମହିଳାମାନଙ୍କ ଦ୍ୱାରା ସଂଶ୍ଳେଷିତ ହୁଏ ନାହିଁ।
MAG ଏବଂ ମହିଳା LRT (ଆଟ୍ରିଆ, ସେମିନାଲ ଭେସିକଲ୍ସ ଏବଂ ପାରୋଭାରିୟମ୍ ସମେତ) 4-ଦିନ ବୟସର (4-ଦିନ ବୟସର) କୁମାରୀ ପୁରୁଷ ଏବଂ କୁମାରୀ ଏବଂ ମିଥ୍ୟା ମହିଳା (0.5, 3, ଏବଂ 12 hpm) ରୁ ବିଚ୍ଛେଦ କରାଯାଇଥିଲା। ଏହି ଟିସୁଗୁଡିକରେ Ecdysone କୁ HPLC-MS/MS (ହାରାହାରି ± sem; ଅଣ-ଯୋଡ଼ା ହୋଇଥିବା t-ପରୀକ୍ଷା, ଦୁଇ-ପାର୍ଶ୍ଵିକ, ମିଥ୍ୟା ଆବିଷ୍କାର ହାର (FDR) ସଂଶୋଧନ ଦ୍ୱାରା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା; NS, ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ନୁହେଁ; *P < 0.05, **P < 0.01। 3D20E: 3 ଘଣ୍ଟା ବନାମ 0.5 ଘଣ୍ଟା, P = 0.035; 12 ଘଣ୍ଟା ବନାମ 3 ଘଣ୍ଟା, P = 0.0015; 12 ଘଣ୍ଟା ବନାମ 0.5 ଘଣ୍ଟା, P = 0.030। 3D20E22P: 3 ଘଣ୍ଟା ବନାମ 0.5 ଘଣ୍ଟା, P = 0.25; 12 ଘଣ୍ଟା ବନାମ 3 ଘଣ୍ଟା, P = 0.0032; 12 ଘଣ୍ଟା ବନାମ 0.5 ଘଣ୍ଟା, P = 0.015)। ତଥ୍ୟ ତିନୋଟି ଜୈବିକ ପ୍ରତିକୃତିରୁ ଆସିଛି। ପ୍ରତ୍ୟେକ ଆଗ୍ରହର ଏକଡିସୋନର ଶିଖର କ୍ଷେତ୍ରକୁ ମଶାଙ୍କ ସଂଖ୍ୟା ଦ୍ୱାରା ଗଣନା ଏବଂ ସ୍ୱାଭାବିକ କରାଯାଇଥିଲା। ଏକଡିସୋନକୁ ନିମ୍ନଲିଖିତ ଭାବରେ ରଙ୍ଗ ଦ୍ୱାରା ଦର୍ଶାଯାଇଛି: E, ସବୁଜ; 20E, କମଳା; 20E22P, ବାଇଗଣୀ; 3D20E, ନୀଳ; 3D20E22P, ଗୋଲାପୀ। ଇନସେଟ୍ ନିମ୍ନ ଏକଡିସୋନ ସ୍ତର ଦେଖାଇବା ପାଇଁ y-ଅକ୍ଷରେ ସ୍କେଲ୍ ବୃଦ୍ଧି କରେ।
ମିଳନ ସମୟରେ 3D20E22P ଏବଂ 3D20E ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ ହୁଏ କି ନାହିଁ ତାହା ଯାଞ୍ଚ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ମିଳନ ପରେ ବିଭିନ୍ନ ସମୟରେ ମହିଳା LRT ଗୁଡିକୁ ବିଚ୍ଛେଦ କରିଥିଲୁ। ଯଦିଓ କୁମାରୀମାନଙ୍କଠାରେ ecdysone ମିଳିନଥିଲା, ଆମେ ମିଳନ ପରେ ତୁରନ୍ତ LRT ରେ 3D20E22P ର ଯଥେଷ୍ଟ ପରିମାଣ ଦେଖିଲୁ (0.5 ଘଣ୍ଟା ପରେ matting, hpm), ସମୟ ସହିତ ହ୍ରାସ ପାଉଥିଲା, ଯେତେବେଳେ 3D20E ସ୍ତର ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 1)। ରାସାୟନିକ ଭାବରେ ସଂଶ୍ଳେଷିତ 3D20E କୁ ଏକ ମାନକ ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରି, ଆମେ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିଥିଲୁ ଯେ ମିଳନ LRT ଗୁଡ଼ିକରେ ଏହି ଷ୍ଟେରଏଡ୍ ହରମୋନର ସ୍ତର 20E ଅପେକ୍ଷା ଅତି କମରେ 100 ଗୁଣ ଅଧିକ ଥିଲା (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ସାରଣୀ 1)। ତେଣୁ, 3D20E22P ହେଉଛି ପ୍ରମୁଖ ପୁରୁଷ ecdysone ଯାହା ମିଳନ ସମୟରେ ମହିଳା LRT କୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ ହୁଏ, ଏବଂ ଏହାର ଡିଫସଫୋରିଲେଟେଡ୍ ରୂପ, 3D20E, ମିଳନ ପରେ ବହୁତ ପ୍ରଚୁର ପରିମାଣରେ ହୋଇଯାଏ। ଏହା ମହିଳା emating ପରବର୍ତ୍ତୀ ଜୀବବିଜ୍ଞାନରେ ପରବର୍ତ୍ତୀ ecdysone ପାଇଁ ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଭୂମିକା ସୂଚାଇଥାଏ।
ଏକ ନୂତନ RNA ସିକୋଇନ୍ସିଂ (RNA-seq) ଡାଟାସେଟ୍ (ଚିତ୍ର 2a) ସୃଷ୍ଟି କରିବା ପରେ, ଏକ କଷ୍ଟମ୍-ନିର୍ମିତ ବାୟୋଇନଫର୍ମେଟିକ୍ସ ପାଇପଲାଇନ୍ ବ୍ୟବହାର କରି, ଆମେ ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), ଏବଂ ecdysone ଏନକୋଡିଂ 20E-ପରିବର୍ତ୍ତିତ ଫସଫେଟେଜ୍ ଜିନ୍ ଖୋଜିଲୁ। EPP) ପ୍ରଜନନ ଟିସୁରେ ପ୍ରକାଶିତ ହୋଇଛି। ଆମେ ଗୋଟିଏ ପ୍ରାର୍ଥୀ EPP ଜିନ୍ ଏବଂ ଦୁଇଟି ସମ୍ଭାବ୍ୟ EcK ଜିନ୍ (EcK1 ଏବଂ EcK2) ଚିହ୍ନଟ କରିଥିଲୁ, କିନ୍ତୁ ଏକ ଭଲ ପ୍ରାର୍ଥୀ EO ଜିନ୍ ପାଇପାରିଲୁ ନାହିଁ। ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ, ବ୍ୟକ୍ତିଗତ EPP ଜିନ୍ ଗାମ୍ବିୟାନ୍ MAGs ରେ ଉଚ୍ଚ ସ୍ତରରେ (98.9ତମ ପ୍ରତିଶତ) ପ୍ରକାଶିତ ହୋଇଥିଲା କିନ୍ତୁ ମହିଳା LRTs (ଚିତ୍ର 2b) ରେ ନୁହେଁ, ଏହି ମହିଳା ଟିସୁରେ 3D20E22P ର ଡିଫସଫୋରିଲେସନ୍ ଘଟିଥିବାରୁ ଆମର ଆଶା ବିପରୀତ। ତେଣୁ, ଆମେ ବିଶ୍ୱାସ କରୁଛୁ ଯେ ପୁରୁଷ EPP ମିଳନ ସମୟରେ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ ହୋଇପାରେ। ପ୍ରକୃତରେ, ଆମେ ମିଳନ ପରେ ମହିଳା ପ୍ରୋଟିନକୁ ମାସ୍କ କରିବା ପାଇଁ ଭିଭୋ ସ୍ଥିର ଆଇସୋଟୋପ୍ ଲେବଲିଂ ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ, ମହିଳା ଆଟ୍ରିଅମ୍ ରେ MS ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ଏକ ଏନଜାଇମ୍ (ଚିତ୍ର 2c ଏବଂ ପରିପୂରକ ସାରଣୀ)। ୧)। ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଆଣ୍ଟିବଡି ବ୍ୟବହାର କରି MAG ଏବଂ ମିତ୍ର (କିନ୍ତୁ କୁମାରୀ ନୁହେଁ) ମହିଳା LRT ରେ EPP ର ଉପସ୍ଥିତି ମଧ୍ୟ ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 2d)।
a, ପ୍ରତ୍ୟେକ ଲିଙ୍ଗର ପ୍ରଜନନ ଟିସୁକୁ EcKs, EOs, ଏବଂ EPPs ଏନକୋଡିଂ କରୁଥିବା ଜିନ୍ ପାଇଁ ସନ୍ଧାନ କରିବା ପାଇଁ ଏକ କଷ୍ଟମ-ନିର୍ମିତ ବାୟୋଇନଫର୍ମେଟିକ୍ସ ପାଇପଲାଇନ୍। ତୀର ପାଖରେ ଥିବା ସଂଖ୍ୟାଗୁଡ଼ିକ ପ୍ରତ୍ୟେକ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ପୁରୁଷ ଏବଂ ମହିଳା ପ୍ରାର୍ଥୀଙ୍କ ସଂଖ୍ୟା ସୂଚାଇଥାଏ। ଏହି ବିଶ୍ଳେଷଣ ପୁରୁଷମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ପ୍ରକାଶିତ ଗୋଟିଏ EPP ଜିନ୍ (EPP) ଏବଂ ଗୋଟିଏ EcK ଜିନ୍ (EcK1) ଏବଂ ଉଭୟ ଲିଙ୍ଗରେ ପ୍ରକାଶିତ ଗୋଟିଏ EcK ଜିନ୍ (EcK2) ଚିହ୍ନଟ କରିଛି, କିନ୍ତୁ ପ୍ରାର୍ଥୀ EO ଜିନ୍ ପ୍ରଦାନ କରେ ନାହିଁ। b, କୁମାରୀ (V) ଏବଂ ମିଳନ (M) ଆନୋଫିଲିସ୍ ଗାମ୍ବିଏ ଏବଂ ଆନୋଫିଲିସ୍ ଆଲବିକାନ୍ସ ଟିସୁରେ ପ୍ରାର୍ଥୀ ଜିନ୍ ପ୍ରକାଶନ ତୁଳନା କରୁଥିବା ହିଟମ୍ୟାପ୍। Spca, ଫର୍ଟିଲାଇଜେସନ୍; MAGs, ପୁରୁଷମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ଆକ୍ସେସରି ଗ୍ରନ୍ଥି; ଶରୀରର ଅନ୍ୟ ଅଂଶ, ସ୍ତନ, ଡେଣା, ଗୋଡ଼, ଚର୍ବି ଶରୀର ଏବଂ ଉଭୟ ଲିଙ୍ଗରେ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ଅଙ୍ଗ ଏବଂ ମହିଳାମାନଙ୍କଠାରେ ଡିମ୍ବାଶୟ। EcK2 ଗାମ୍ବିଆର MAG ଏବଂ ଆଟ୍ରିଆ ଉଭୟରେ ଅତ୍ୟନ୍ତ ପ୍ରକାଶିତ ହୁଏ, ଯେତେବେଳେ EPP କେବଳ MAG.c ରେ ଦେଖାଯାଏ, ପୁରୁଷ ବୀର୍ଯ୍ୟପାତ ଗୋଷ୍ଠୀର ମହିଳା ଆଟ୍ରିଆରେ ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣର ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ 3, 12 ଏବଂ 24 hpm ରେ, ଯାହା 67 ଟି ସର୍ବାଧିକ ପ୍ରଚୁର ପ୍ରୋଟିନ୍ ଦେଖାଏ। ମହିଳାମାନଙ୍କୁ ସମସ୍ତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଲେବଲ୍ (ଏବଂ ମାସ୍କ) କରିବା ପାଇଁ 15N ଯୁକ୍ତ ଖାଦ୍ୟରେ ପାଳନ କରାଯାଇଥିଲା। ଟ୍ୟାଗ୍ ନ ହୋଇଥିବା ପୁରୁଷମାନଙ୍କୁ ଟ୍ୟାଗ୍ ହୋଇଥିବା ମହିଳାମାନଙ୍କ ସହିତ ମିଳନ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ମହିଳା LRT ଗୁଡ଼ିକୁ 3, 12 ଏବଂ 24 hpm ରେ ବିଚ୍ଛେଦ କରାଯାଇଥିଲା (ସ୍ଖଳନ ପ୍ରୋଟିନ୍ ର ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ତାଲିକା ପାଇଁ ପରିପୂରକ ସାରଣୀ 1 ଦେଖନ୍ତୁ)। ଏହି ଟିସୁଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦ୍ୱାରା କୁମାରୀ ପୁରୁଷମାନଙ୍କ MAG ରେ ଇନସେଟ୍, EPP, Eck1 ଏବଂ EcK2 ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା। d, EPP MAG ରେ ପଶ୍ଚିମ ବ୍ଲଟ୍ ଏବଂ ମିତ୍ର ହୋଇଥିବା ମହିଳାମାନଙ୍କ LRT ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା, କିନ୍ତୁ କୁମାରୀ ମହିଳା କିମ୍ବା ପୁରୁଷ କିମ୍ବା ବାକି ମହିଳାଙ୍କ କ୍ଷେତ୍ରରେ ନୁହେଁ। ଶରୀର। ଝିଲ୍ଲୀଗୁଡ଼ିକୁ ଏକକାଳୀନ ଆଣ୍ଟି-ଆକ୍ଟିନ୍ (ଲୋଡିଂ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ) ଏବଂ ଆଣ୍ଟି-EPP ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ଯାଞ୍ଚ କରାଯାଇଥିଲା। ସମସ୍ତ ପୁରୁଷ କୁମାରୀ। ଜେଲ୍ ଉତ୍ସ ତଥ୍ୟ ପାଇଁ ପରିପୂରକ ଚିତ୍ର 1 ଦେଖନ୍ତୁ। ସମାନ ଫଳାଫଳ ସହିତ ପଶ୍ଚିମ ବ୍ଲଟ୍ ଦୁଇଥର କରାଯାଇଥିଲା।
MAG (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ଚିତ୍ର 2a) ରୁ ପୃଥକ 3D20E22P ସହିତ HPLC-MS/MS ଦ୍ୱାରା ଇନକ୍ୟୁବେସନ ପରେ EPP ର ଏକଡିଷ୍ଟେରଏଡ୍ ଫସଫୋସଫେଟେଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଯାଞ୍ଚ କରାଯାଇଥିଲା। ଏହା ବ୍ୟତୀତ, ଯେତେବେଳେ ଆମେ RNA-ମଧ୍ୟସ୍ଥ ହସ୍ତକ୍ଷେପ (RNAi) ଦ୍ୱାରା EPP କୁ ନୀରବ କରିଥିଲୁ, ଆମେ ଏହି ପୁରୁଷମାନଙ୍କ ପ୍ରଜନନ ଟିସୁରେ ଫସଫେଟେଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପରେ ଏକ ଦୃଢ଼ ହ୍ରାସ ଚିହ୍ନଟ କରିଥିଲୁ (ଚିତ୍ର 3a), ଏବଂ EPP-ନିରବ ପୁରୁଷମାନଙ୍କ ସହିତ ମିଶିଥିବା ମହିଳାମାନେ ଆଂଶିକ ଜିନ୍ ନୀରବତା ସତ୍ତ୍ୱେ ଡିଫସଫୋରିଲେଟେଡ୍ 3D20E (ଚିତ୍ର 3b) ର ଏକ କମ୍ ଅନୁପାତ ଦେଖାଇଥିଲେ (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ଚିତ୍ର 2b,c)। ବିପରୀତରେ, ଆମେ ସମାନ ମଶାରେ 20E22P/20E ଅନୁପାତରେ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପରିବର୍ତ୍ତନ ଚିହ୍ନଟ କରିନଥିଲୁ, ଯାହା ସୂଚାଇପାରେ ଯେ ଏନଜାଇମ୍ 3D20E22P ପାଇଁ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ (ଚିତ୍ର 3b)।
a, ଡବଲ୍-ଷ୍ଟ୍ରେଣ୍ଡେଡ୍ EPP RNA (dsEPP) କିମ୍ବା ଡବଲ୍-ଷ୍ଟ୍ରେଣ୍ଡେଡ୍ GFP RNA (dsGFP) ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ବ୍ୟବହାର କରି EPP ସାଇଲେନ୍ସିଂ ଯୋଗୁଁ MAG ରେ ଫସଫେଟେଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ହ୍ରାସ ପାଇଥିଲା। ପ୍ରତ୍ୟେକ ପ୍ରତିକୃତି (P = 0.0046, ପେୟାରଡ୍ t-ପରୀକ୍ଷଣ, ଦୁଇ-ପାର୍ଶ୍ଵ) ରେ କୋଡ଼ିଏ MAG ପୁଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା ପୃଥକ ବିନ୍ଦୁ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରାଯାଇଥିଲା। b, EPP-ସିଲେନ୍ସଡ୍ ପୁରୁଷମାନଙ୍କ ସହିତ ମିଳନ ହୋଇଥିବା ମହିଳାମାନଙ୍କ 3 hpm (P = 0.0043, ଅଣପେୟାରଡ୍ t-ପରୀକ୍ଷଣ, ଦୁଇ-ପାର୍ଶ୍ଵ) ରେ ଡିଫସଫୋରିଲେଟେଡ୍ 3D20E ର ଅନୁପାତ ଯଥେଷ୍ଟ କମ୍ ଥିଲା, ଯେତେବେଳେ 20E ସ୍ତର ପ୍ରଭାବିତ ହୋଇନଥିଲା (P = 0.063, ଅଣପେୟାରଡ୍)। ଟି-ପରୀକ୍ଷା, ଦୁଇ-ପାର୍ଶ୍ଵ)। ୧୩, ୧୬ ଏବଂ ୧୯ ମହିଳା ପ୍ରତ୍ୟେକଙ୍କ ତିନୋଟି ପୁଲରୁ ତଥ୍ୟକୁ ହାରାହାରି ± ସେମ୍ ଭାବରେ ଉପସ୍ଥାପିତ କରାଯାଇଛି। c, EPP-ନିରବ ପୁରୁଷମାନଙ୍କ ସହିତ ମିଳନ କରିଥିବା ମହିଳାମାନଙ୍କର ପୁନଃମିଳନର ହାର ଯଥେଷ୍ଟ ଅଧିକ ଥିଲା (P = 0.0002, ଫିସରଙ୍କ ସଠିକ୍ ପରୀକ୍ଷା, ଦୁଇ-ପାର୍ଶ୍ଵ)। ସେମାନଙ୍କ ମିଳନ ସ୍ଥିତି ନିଶ୍ଚିତ କରିବା ପାଇଁ ପ୍ରଥମେ ମହିଳାମାନଙ୍କୁ ସହବାସ କରିବାକୁ ବାଧ୍ୟ କରାଯାଇଥିଲା; 2 ଦିନ ପରେ, ଟ୍ରାନ୍ସଜେନିକ୍ ଶୁକ୍ରାଣୁ ବହନ କରୁଥିବା ଅନ୍ୟ ପୁରୁଷମାନଙ୍କ ସହିତ ସେମାନଙ୍କ ଯୋଗାଯୋଗ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା ଦ୍ୱାରା ଟ୍ରାନ୍ସଜିନ୍‌ର ପରିମାଣାତ୍ମକ PCR ଚିହ୍ନଟ ଦ୍ୱାରା ପୁନଃମିଳନ ହାର ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରାଯାଇଥିଲା। EPP-ନିରବ ପୁରୁଷମାନଙ୍କ ସହିତ ମିଶିଥିବା ରକ୍ତ-ପୋଷିତ ମହିଳାମାନଙ୍କର ପ୍ରଜନନ କ୍ଷମତା ଯଥେଷ୍ଟ ହ୍ରାସ ପାଇଥିଲା (P < 0.0001; ମାନ-ହ୍ୱିଟନି ପରୀକ୍ଷା, ଦୁଇ-ପାର୍ଶ୍ଵ) ଏବଂ ଡିମ୍ବାଣୁ ସଂଖ୍ୟା ସାମାନ୍ୟ ହ୍ରାସ ପାଇଥିଲା (P = 0.088, ମାନ-ହ୍ୱିଟନି ପରୀକ୍ଷା, ଦୁଇ-ପାର୍ଶ୍ଵ), ଯେତେବେଳେ ପ୍ରଜନନ ହାର ପ୍ରଭାବିତ ହୋଇନଥିଲା (P = 0.94, ଫିସରଙ୍କ ସଠିକ୍ ପରୀକ୍ଷା, ଦୁଇ-ପାର୍ଶ୍ଵ)। ସମସ୍ତ ପ୍ୟାନେଲରେ, n ଜୈବିକ ଭାବରେ ସ୍ୱାଧୀନ ମଶା ନମୁନା ସଂଖ୍ୟାକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ। NS, ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ନୁହେଁ।*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001।
ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ, ଆମେ ମୂଲ୍ୟାୟନ କଲୁ ଯେ ମହିଳାମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ମିଳନ ପ୍ରତିରୋଧ ସୃଷ୍ଟି କରିବା ପାଇଁ ଏକଡିସୋନ୍ ଡିଫସଫୋରିଲେସନ୍ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ କି ନାହିଁ। ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ, ଅତିରିକ୍ତ (ଟ୍ରାନ୍ସଜେନିକ୍) ପୁରୁଷମାନଙ୍କ ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ ହେବା ସମୟରେ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ମହିଳାମାନଙ୍କ (୧୦.୪%) ତୁଳନାରେ EPP-କ୍ଷୟପ୍ରାପ୍ତ ପୁରୁଷମାନଙ୍କ ସହିତ ମିଳନ ହୋଇଥିବା ମହିଳାମାନେ ବହୁତ ଅଧିକ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସୀ (୪୪.୯%) ରେ ପୁନଃ ମିଳନ କରିଥିଲେ (ଚିତ୍ର 3d, ବାମ)। ଆମେ ପ୍ରଜନନଶକ୍ତିରେ ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ହ୍ରାସ (ଚିତ୍ର 3d, ବାମ) ଏବଂ ଏହି ମହିଳାମାନଙ୍କ ଦ୍ୱାରା ଦିଆ ଯାଇଥିବା ଅଣ୍ଡା ସଂଖ୍ୟାରେ ସାମାନ୍ୟ ହ୍ରାସ ମଧ୍ୟ ଦେଖିଲୁ (ଚିତ୍ର 3d, ମଧ୍ୟମ), ଯେତେବେଳେ ମହିଳାମାନଙ୍କ ଦ୍ୱାରା ଦିଆ ଯାଇଥିବା ଅଣ୍ଡାର ପ୍ରତିଶତ (ମିଳନ ଦ୍ୱାରା ମହିଳାମାନଙ୍କଠାରେ ପ୍ରାପ୍ତ ଅନ୍ୟ ଏକ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା) ପ୍ରଭାବିତ ହୋଇନଥିଲା (ଚିତ୍ର 3d, ଡାହାଣ)। 3D20E22P ପାଇଁ EPP ର ପରିଲକ୍ଷିତ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତାକୁ ଦୃଷ୍ଟିରେ ରଖି, ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକ ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ ମିଳନ ସମୟରେ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ EPP ଦ୍ୱାରା 3D20E ର ସକ୍ରିୟକରଣ ଅଧିକ ମିଳନ ପାଇଁ ମହିଳା ଗ୍ରହଣଶୀଳତାକୁ ବନ୍ଦ କରିବାରେ ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଭୂମିକା ନେଇପାରେ, ପୂର୍ବରୁ 20E ର ଯୌନ ସ୍ଥାନାନ୍ତର ପାଇଁ ଦାୟୀ ଏକ ଆଚରଣ। ତେଣୁ, ଏହି ପୁରୁଷ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ହରମୋନ୍ ମଧ୍ୟ ମହିଳା ପ୍ରଜନନଶକ୍ତିକୁ ଦୃଢ଼ ଭାବରେ ପ୍ରଭାବିତ କରେ।
ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ, ଆମେ ରାସାୟନିକ ଭାବରେ ସଂଶ୍ଳେଷିତ 3D20E (ଚିତ୍ର 4a–c) ଏବଂ ବାଣିଜ୍ୟିକ ଭାବରେ ଉପଲବ୍ଧ 20E ବ୍ୟବହାର କରି ଯୌନ ପରିପକ୍ୱ କୁମାରୀମାନଙ୍କ ଉପରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ପରୀକ୍ଷଣରେ 20E ଏବଂ 3D20E ର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ତୁଳନା କଲୁ। ଆମେ ଦେଖିଲୁ ଯେ 3D20E ଉଭୟ ସାନ୍ଦ୍ରତାରେ ମିଳନ ପ୍ରତି ମହିଳା ସମ୍ବେଦନଶୀଳତାକୁ ବନ୍ଦ କରିବାରେ 20E ଅପେକ୍ଷା ଯଥେଷ୍ଟ ଅଧିକ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ଥିଲା (ଚିତ୍ର 4d)। ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ, LRT ରେ 3D20E ର ଅଧା ଶାରୀରିକ ସ୍ତର (1,066 pg ପୋଷ୍ଟ-ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ବନାମ 2,022 pg ପୋଷ୍ଟ-ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ) ଏକ ପ୍ରତିରୋଧକ ମହିଳାମାନଙ୍କର ଏକ ଅନୁପାତକୁ ପ୍ରେରିତ କରିଥିଲା ​​ଯାହା ସର୍ବାଧିକ ସାନ୍ଦ୍ରତା 18 pg ପୋଷ୍ଟ-ଇଞ୍ଜେକ୍ସନରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ପରେ 24 ଘଣ୍ଟା ପରେ 20E (361 pg ପୋଷ୍ଟ-ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ) ର ଶାରୀରିକ ସ୍ତର ଅପେକ୍ଷା 20 ଗୁଣ ଅଧିକ ଥିଲା; ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ସାରଣୀ 1)। ଏହି ଫଳାଫଳ ଏହି ଧାରଣା ସହିତ ସୁସଙ୍ଗତ ଯେ 20E ର ଯୌନ ସ୍ଥାନାନ୍ତର ମିଳନ ପ୍ରତିରୋଧକ ଅବଧି ସୃଷ୍ଟି କରେ ନାହିଁ, ଏବଂ ଏହା ପିତାମାତା-ସନ୍ତାନ ସମ୍ପର୍କ ସୁନିଶ୍ଚିତ କରିବାରେ ଏକ ପ୍ରମୁଖ କାରକ ଭାବରେ 3D20E କୁ ସୂଚିତ କରେ। କୁମାରୀ ମହିଳାମାନଙ୍କଠାରେ ଅଣ୍ଡା ଦେବା ପରୀକ୍ଷାରେ 3D20E ମଧ୍ୟ 20E ଅପେକ୍ଷା ଯଥେଷ୍ଟ ଅଧିକ ସକ୍ରିୟ ଥିଲା (ଚିତ୍ର 4e), ଯାହା ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ ଆଂଶିକ EPP ନୀରବତା ପରେ ଆମେ ଯେଉଁ ସାଧାରଣ ଅଣ୍ଡା ଦେବା ହାର ଦେଖିଥିଲୁ ତାହା ମିଳନ-ପ୍ରେରିତ ମହିଳା କାରକ ଦ୍ୱାରା ଉତ୍ପାଦିତ ଅବଶିଷ୍ଟ 3D20E କାର୍ଯ୍ୟକଳାପର ଉପସ୍ଥିତି ଯୋଗୁଁ ହୋଇଥିଲା।
(a,b) 3D20E ରାସାୟନିକ ଭାବରେ 20E (a) ରୁ ସଂଶ୍ଳେଷିତ, ଯାହା ବହୁତ ଉଚ୍ଚ ରୂପାନ୍ତର/ଦକ୍ଷତା ସହିତ (ତିନୋଟି ସ୍ୱାଧୀନ ସଂଶ୍ଳେଷଣ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରୁ ହାରାହାରି ± sem ଭାବରେ ଉପସ୍ଥାପିତ ତଥ୍ୟ) (b).c, ଗଣ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମ୍ (ତଳ ଅଧା) ମିଶାଣିତ ମହିଳା LRT (ଉପର ଅଧା) ରେ ମିଳୁଥିବା ecdysone ସହିତ ଠିକ୍ ମେଳ ଖାଏ।d, 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; ଫିସରଙ୍କ ସଠିକ୍ ପରୀକ୍ଷା, ଦୁଇ-ପାର୍ଶ୍ଵ) ଏବଂ 10% ଇଥାନଲ୍ (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; ଫିସରଙ୍କ ସଠିକ୍ ପରୀକ୍ଷା, 2-ପାର୍ଶ୍ଵ) ସହିତ ତୁଳନା କରାଯାଇଛି, ଯେତେବେଳେ 20E କେବଳ ଅଧିକ ମାତ୍ରାରେ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଅପେକ୍ଷା ଯଥେଷ୍ଟ ଅଧିକ ଥିଲା (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; ଫିସରଙ୍କ ସଠିକ୍ ପରୀକ୍ଷା, 2-ପାର୍ଶ୍ଵ).e, 3D20E ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ 10% ଇଥାନଲ୍ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; ଫିସରଙ୍କ ସଠିକ୍ ପରୀକ୍ଷା, ଦୁଇ-ପାର୍ଶ୍ଵ) ତୁଳନାରେ କୁମାରୀ ମହିଳାମାନଙ୍କଠାରେ ଯଥେଷ୍ଟ ଅଧିକ ଅଣ୍ଡାଦାନ ହାର ପ୍ରେରଣା ଦେଇଥିଲା, ଯେତେବେଳେ 20E ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ତୁଳନାରେ କେବଳ ଅଧିକ ମାତ୍ରାରେ (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; ଫିସରଙ୍କ ସଠିକ୍ ପରୀକ୍ଷା, ଦୁଇ-ପାର୍ଶ୍ଵ).3D20E ଅଧିକ ମାତ୍ରାରେ 20E ଅପେକ୍ଷା ଯଥେଷ୍ଟ ଅଧିକ ଅଣ୍ଡାଦାନ ହାର ପ୍ରେରଣା କରିଥିଲା ​​(0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; ଫିସରଙ୍କ ସଠିକ୍ ପରୀକ୍ଷା, ଦୁଇ-ପାର୍ଶ୍ଵ). ସମସ୍ତ ପ୍ୟାନେଲରେ, n ଜୈବିକ ଭାବରେ ସ୍ୱାଧୀନ ମଶା ନମୁନାର ସଂଖ୍ୟାକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ।NS, ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ନୁହେଁ।*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001। ତଥ୍ୟ ତିନୋଟି ପ୍ରତିକୃତିରୁ ଆସିଛି।
ପୂର୍ବ ଅଧ୍ୟୟନରେ, ଆମେ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିଥିଲୁ ଯେ ଷ୍ଟେରଏଡ୍ ହରମୋନର ଯୌନ ସ୍ଥାନାନ୍ତର MISO (ମେଟିଂ-ଇଣ୍ଡ୍ୟୁସଡ୍ ଷ୍ଟିମୁଲେଟର ଅଫ୍ Oogenesis 11) ର ପ୍ରକାଶନକୁ ପ୍ରେରଣା ଦିଏ, ଏକ ମହିଳା ପ୍ରଜନନ ଜିନ୍ ଯାହା A. gambiae ମହିଳାମାନଙ୍କୁ P. falciparum ସଂକ୍ରମଣରୁ ରକ୍ଷା କରେ। 13 ଦ୍ୱାରା ହେଉଥିବା ସ୍ୱାସ୍ଥ୍ୟ ଖର୍ଚ୍ଚ, ସବୁଠାରୁ ମାରାତ୍ମକ ମାନବ ମ୍ୟାଲେରିଆ ପରଜୀବୀ। ମ୍ୟାଲେରିଆ-ସ୍ଥାନୀୟ କ୍ଷେତ୍ରରେ ଆନୋଫିଲିସ୍ ର ପ୍ରଜନନ ଫିଟନେସ୍ ପାଇଁ MISO ର ଗୁରୁତ୍ୱକୁ ଦୃଷ୍ଟିରେ ରଖି, ଆମେ କେଉଁ ହରମୋନ୍ 3D20E କିମ୍ବା 20E ଏହି ଜିନ୍ ର ପ୍ରକାଶନକୁ ଟ୍ରିଗର କରେ ତାହା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବାକୁ ନିଷ୍ପତ୍ତି ନେଇଛୁ। ଆମେ ପାଇଲୁ ଯେ 20E ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଭାବରେ କିମ୍ବା ଅଧିକ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ଭାବରେ କିଛି ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟର ହରମୋନ୍ ରିସେପ୍ଟର (HR), ଯେପରିକି HR3 ଏବଂ HR4, ଏବଂ ସାଧାରଣ ଡାଉନଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ଷ୍ଟେରଏଡ୍ ଲକ୍ଷ୍ୟ, ଯେପରିକି yolkogenic ଜିନ୍ Vg14, 15, 16, MISO ଅଧିକ ଦୃଢ଼ ଭାବରେ 3D20E (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ଚିତ୍ର 3) ଦ୍ୱାରା ପ୍ରେରିତ ହୋଇଥିଲା। ତେଣୁ, ଏହି ଆଣ୍ଡ୍ରୋଜେନିକ୍ ଷ୍ଟେରଏଡ୍ ହରମୋନର ଯୌନ ସ୍ଥାନାନ୍ତର ଏପରି ଯନ୍ତ୍ରପାତିର ପ୍ରକାଶନ କରେ ଯାହା ପରଜୀବୀ ସଂକ୍ରମଣ ଦ୍ୱାରା ହେଉଥିବା ଖର୍ଚ୍ଚରୁ ମହିଳାମାନଙ୍କୁ ସୁରକ୍ଷା ଦିଏ। ଅଧିକନ୍ତୁ, 3D20E E ରିସେପ୍ଟର EcR ର ଉଭୟ ଆଇସୋଫର୍ମକୁ ଭିନ୍ନ ଭାବରେ ପ୍ରଭାବିତ କରେ, EcR-A ପ୍ରେରଣା ଦିଏ ଏବଂ EcR-B ଦମନ କରେ, ଏବଂ HPX15 ସମେତ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ମିଳନ-ପ୍ରେରଣାଦାୟକ ଜିନ୍ କୁ ଅଧିକ ଦୃଢ଼ ଭାବରେ ଟ୍ରିଗର କରେ, ଯାହା ମହିଳା ପ୍ରଜନନଶକ୍ତିକୁ ପ୍ରଭାବିତ କରେ। ଏହା EPP-ନିରବ ପୁରୁଷମାନଙ୍କ ସହିତ ମିଳନ ହୋଇଥିବା ମହିଳାମାନଙ୍କଠାରେ ପରିଲକ୍ଷିତ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ବନ୍ଧ୍ୟାତ୍ବକୁ ବ୍ୟାଖ୍ୟା କରିପାରେ (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ଚିତ୍ର 3)। ଏହି ତଥ୍ୟ ଦୁଇଟି ecdysone ହରମୋନ ଦ୍ୱାରା ଅଗ୍ରାଧିକାର ଭାବରେ ସକ୍ରିୟ ହୋଇଥିବା ଡାଉନଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ପଥଗୁଡ଼ିକର ଅସ୍ତିତ୍ୱକୁ ସୂଚାଇଥାଏ ଯାହା ଲିଙ୍ଗ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ମୂଳ କରିପାରେ।
ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ, ଆମେ ଆମର ବାୟୋଇନଫର୍ମେଟିକ୍ସ ପାଇପଲାଇନରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ଦୁଇଟି EcK ଜିନର କାର୍ଯ୍ୟ ପରୀକ୍ଷା କରିଥିଲୁ। EcK1 କିମ୍ବା EcK2 କୁ ନୀରବ କରିବା ଫଳରେ ପୁରୁଷମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ମୃତ୍ୟୁହାର ହୋଇଥିଲା (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ଚିତ୍ର 4a), ଯାହା ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ecdysone ଫସଫୋରାଇଲେସନ୍, ଏବଂ ତେଣୁ ନିଷ୍କ୍ରିୟତା, ବଞ୍ଚିବା ପାଇଁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ। କାରଣ EcK2 EcK1 ଅପେକ୍ଷା ଉଚ୍ଚ ସ୍ତରରେ ପ୍ରକାଶିତ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ସ ଦ୍ୱାରା MAGs ରେ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 2b,c ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ସାରଣୀ 2), ଆମେ 20E ସହିତ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରି ଏହାର ecdysteroid kinase କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ବୈଧ କରିଥିଲୁ, ଯାହାର ପରିଣାମସ୍ୱରୂପ ଫସଫୋରାଇଲେସନ୍ 20E22P (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ଚିତ୍ର 2) ହୋଇଥିଲା। 3D20E କୁ ଏକ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରିବା ସମୟରେ, ଆମେ ଫସଫୋରାଇଲେଟେଡ୍ ଉତ୍ପାଦ 3D20E22P (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ଚିତ୍ର 4c) ଚିହ୍ନଟ କରିପାରି ନଥିଲୁ, ଯାହା ସୂଚାଇଥିଲା ଯେ 3D20E ବଦଳରେ 20E EcK2 ର ପସନ୍ଦିତ ଲକ୍ଷ୍ୟ ହୋଇପାରେ।
ଆମର RNA-seq ବିଶ୍ଳେଷଣ ଅନୁସାରେ, କୁମାରୀ ମହିଳାମାନଙ୍କ LRT ରେ EcK2 ମଧ୍ୟ ଅତ୍ୟନ୍ତ ପ୍ରକାଶିତ ହୋଇଥିଲା, ଯେଉଁଠାରେ ଏହା ମିଳନ ପରେ ବନ୍ଦ ହୋଇଯାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 2b)। ଆମେ ଏହି ତଥ୍ୟଗୁଡ଼ିକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରିଥିଲୁ ଏବଂ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିଥିଲୁ ଯେ EcK2 ପ୍ରକାଶନ ରକ୍ତ ଖାଇବା ଦ୍ୱାରା ପ୍ରଭାବିତ ହୋଇନଥିଲା (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ଚିତ୍ର 5a)। ଆମର ପ୍ରାରମ୍ଭିକ MS ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡ଼ିକୁ ବିସ୍ତାର କରି, ଆମେ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିଥିଲୁ ଯେ 20E22P ର ଶିଖର 20E ର ଶିଖର ସହିତ ନିକଟତର ଥିଲା (ରକ୍ତ ଖାଇବା ପରେ 22-26 ଘଣ୍ଟା; ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ଚିତ୍ର 5b)। କୁମାରୀ ମହିଳାମାନଙ୍କଠାରେ EcK2 ର ନୀରବତା ରକ୍ତ ଖାଇବା ପରେ 26 ଘଣ୍ଟାରେ 20E ରୁ 20E22P ର ଆପେକ୍ଷିକ ଅନୁପାତରେ 3 ଗୁଣ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଥିଲା (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ଚିତ୍ର 2c ଏବଂ 5c), ଏହା ନିଶ୍ଚିତ କରିଥିଲୁ ଯେ EcK2 ମହିଳାମାନଙ୍କଠାରେ 20E କୁ ଫସଫୋରିଲେଟ୍ ମଧ୍ୟ କରେ। ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ, EcK2-କ୍ଷୟପ୍ରାପ୍ତ କୁମାରୀମାନେ ପୂର୍ଣ୍ଣ ଯୌନ ଗ୍ରହଣଶୀଳତା ବଜାୟ ରଖନ୍ତି (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ଚିତ୍ର 5d,e), ଆହୁରି ସୂଚାଇ ଦେଉଛି ଯେ 20E ର ମହିଳା ଉତ୍ପାଦନ ମିଳନ ପ୍ରତିରୋଧକ ପ୍ରବର୍ତ୍ତନ କରେ ନାହିଁ। ପିରିୟଡ୍ସ। ତଥାପି, ଏହି ମହିଳାମାନଙ୍କ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ତୁଳନାରେ ଅଣ୍ଡା ଦେବା ହାର ଯଥେଷ୍ଟ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଥିଲା, 30% ରୁ ଅଧିକ କୁମାରୀମାନେ ଅଣ୍ଡା ଦେଇଥାନ୍ତି (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ଚିତ୍ର 5f)। ଯଦି ରକ୍ତପାନ ପରେ ଡବଲ-ଷ୍ଟ୍ରେଣ୍ଡେଡ୍ Eck2 RNA (dsEcK2) ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ କରାଯାଇଥାଏ, ତେବେ ଅଣ୍ଡାଦାନ ଘଟିନଥାଏ, ଯେଉଁଠାରେ ରକ୍ତ ଗ୍ରହଣ ଯୋଗୁଁ 20E ଶିଖର ହ୍ରାସ ପାଇଥାଏ। ସାମଗ୍ରିକ ଭାବରେ, ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକ ଏକ ମଡେଲକୁ ସମର୍ଥନ କରେ ଯେ ରକ୍ତ ଶୋଷଣ ପରେ ଉତ୍ପାଦିତ 20E ଅଣ୍ଡାଦାନକୁ ପ୍ରବର୍ତ୍ତାଇପାରେ, କିନ୍ତୁ କେବଳ ଯେତେବେଳେ ଅଣ୍ଡାଦାନ ବ୍ଲକ (EcK2 ଏବଂ ସମ୍ଭବତଃ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ କାରଣ) ମିଳନ ଦ୍ୱାରା ବନ୍ଦ ହୋଇଯାଏ। 20E କିମ୍ବା 3D20E ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ କୁମାରୀମାନଙ୍କରେ EcK2 ପ୍ରକାଶନକୁ ବାଧା ଦେଇନଥିଲା (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ଚିତ୍ର 5g), ଯାହା ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ ଅନ୍ୟ କାରଣଗୁଡ଼ିକ ଏହି କାଇନେଜର ପ୍ରତିରୋଧକୁ ମଧ୍ୟସ୍ଥତା କରନ୍ତି। ତଥାପି, ରକ୍ତପାନ ପରେ 20E ସ୍ତର ମିଳନ ଅସ୍ୱସ୍ତିକୁ ପ୍ରବର୍ତ୍ତାଇବା ପାଇଁ ଯଥେଷ୍ଟ ନଥିଲା, କିନ୍ତୁ ଯୌନ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ 3D20E ର ଉଚ୍ଚ ଟାଇଟର ଦ୍ୱାରା ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ଭାବରେ ଟ୍ରିଗର ହୋଇଥିଲା।
ଆମର ଫଳାଫଳ A. gambiae ର ପ୍ରଜନନ ସଫଳତାକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରୁଥିବା ଯନ୍ତ୍ରପାତି ବିଷୟରେ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଅନ୍ତର୍ଦୃଷ୍ଟି ପ୍ରଦାନ କରେ। ଏକ ମଡେଲ ଉଭା ହୋଇଛି ଯେଉଁଠାରେ ପୁରୁଷମାନେ 3D20E ର ଉଚ୍ଚ ଟାଇଟରଗୁଡ଼ିକୁ ସଂଶ୍ଳେଷଣ କରିବାକୁ ବିକଶିତ ହୋଇଛନ୍ତି, ଏକ ପୁରୁଷ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପରିବର୍ତ୍ତିତ ecdysone ଯାହା ମହିଳାମାନଙ୍କୁ ଅଧିକ ମିଳନ ପାଇଁ ସମ୍ବେଦନଶୀଳ କରି ପିତାମାତାଙ୍କୁ ନିଶ୍ଚିତ କରେ। ସେହି ସମୟରେ, ଏହି ମ୍ୟାଲେରିଆ ଭେକ୍ଟରମାନେ ପୁରୁଷ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ EPP ର ଯୌନ ସ୍ଥାନାନ୍ତରର ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ମହିଳାମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ 3D20E ସକ୍ରିୟ କରିବା ପାଇଁ ଏକ ଦକ୍ଷ ପ୍ରଣାଳୀ ମଧ୍ୟ ବିକଶିତ କରିଛନ୍ତି। ଆମ ଜ୍ଞାନ ଅନୁସାରେ, ଏହା କୀଟପତଙ୍ଗରେ ଏକ ଅନନ୍ୟ ଏବଂ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ କାର୍ଯ୍ୟ କରୁଥିବା ପୁରୁଷ- ଏବଂ ମହିଳା-ପ୍ରଧାନ ଷ୍ଟେରଏଡ୍ ହରମୋନ୍ ସିଷ୍ଟମର ପ୍ରଥମ ଉଦାହରଣ। ପୁରୁଷ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ecdysone କାର୍ଯ୍ୟକୁ ପୋଜିକ୍ୟୁଲେଟ୍ କରାଯାଇଛି କିନ୍ତୁ ନିଶ୍ଚିତ ଭାବରେ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରାଯାଇ ନାହିଁ। ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, ଏକ ବହୁଳ ଭାବରେ ଅପ୍ରମାଣିତ ପରିକଳ୍ପନା 18 ହେଉଛି ଯେ ଏହି କାର୍ଯ୍ୟଗୁଡ଼ିକ 20E ପୂର୍ବବର୍ତ୍ତୀ E1 ଦ୍ୱାରା ସମ୍ପାଦିତ ହୋଇପାରେ। ଏହା ଜଣାଶୁଣା ଯେ ଡ୍ରୋସୋଫିଲାରେ, ମୋନାଣ୍ଡ୍ରି ଛୋଟ ଲିଙ୍ଗ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ 19,20 ର ଯୌନ ସ୍ଥାନାନ୍ତର ଦ୍ୱାରା ଟ୍ରିଗର ହୁଏ ଯାହା ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଲିଙ୍ଗ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ରିସେପ୍ଟର 21,22 ମାଧ୍ୟମରେ ମହିଳା ପ୍ରଜନନ ପଥରୁ ଅନ୍ତର୍ନିହିତ ନ୍ୟୁରନ୍ ସହିତ ଯୋଗାଯୋଗ କରେ। ଅଧିକ କାର୍ଯ୍ୟ ହେଉଛି A. gambiae ମହିଳାମାନଙ୍କଠାରେ 3D20E ଦ୍ୱାରା ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ଡାଉନଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ସିଗନାଲିଂ କାସ୍କେଡ୍ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବା ଏବଂ ଏହି କାସ୍କେଡ୍ ଗୁଡ଼ିକୁ ମଶା ଏବଂ ଡ୍ରୋସୋଫିଲା ମଧ୍ୟରେ ସଂରକ୍ଷଣ କରାଯାଇପାରିବ କି ନାହିଁ ତାହା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବା ଆବଶ୍ୟକ।
ଆମ ଅଧ୍ୟୟନରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ମହିଳା ପ୍ରଜନନ ଏବଂ ଆଚରଣ ଉପରେ 3D20E ର ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଭୂମିକାକୁ ଦୃଷ୍ଟିରେ ରଖି, 3D20E ସଂଶ୍ଳେଷଣ ଏବଂ ସକ୍ରିୟକରଣ ପାଇଁ ପ୍ରବର୍ତ୍ତନ କରୁଥିବା ପଥଗୁଡ଼ିକ ଭବିଷ୍ୟତର ମଶା ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ରଣନୀତି ପାଇଁ ନୂତନ ସୁଯୋଗ ପ୍ରଦାନ କରେ, ଯେପରିକି ଜୀବାଣୁମୁକ୍ତ କୀଟ ପ୍ରଯୁକ୍ତି କୌଶଳରେ ପ୍ରତିଯୋଗିତାମୂଳକ ଜୀବାଣୁମୁକ୍ତ ପୁରୁଷଙ୍କ ସୃଷ୍ଟି ଜଙ୍ଗଲୀ ମୁକ୍ତି ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ କିମ୍ବା କୁମାରୀ ଖେଳରେ 3D20E ଅନୁକରଣ କରନ୍ତୁ। 3D20E ର ପୁରୁଷ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କାର୍ଯ୍ୟ ସେତେବେଳେ ବିକଶିତ ହୋଇଥାଇପାରେ ଯେତେବେଳେ A. gambiae ଏବଂ ଅନ୍ୟ Cellia ପ୍ରଜାତି ସେମାନଙ୍କର ବୀର୍ଯ୍ୟକୁ ମିଳନ ପ୍ଲଗରେ ଜମାଟ ବାନ୍ଧିବାର କ୍ଷମତା ହାସଲ କରିଥିଲେ, କାରଣ ଏହା ବହୁ ସଂଖ୍ୟକ ହରମୋନ୍ ଏବଂ ହରମୋନ୍-ସକ୍ରିୟକାରୀ ଏନଜାଇମଗୁଡ଼ିକର ଦକ୍ଷ ସ୍ଥାନାନ୍ତର ପାଇଁ ଅନୁମତି ଦିଏ। ପରିବର୍ତ୍ତେ, 3D20E ବିବର୍ତ୍ତନ କାର୍ଯ୍ୟକାରୀ ମୋନାଣ୍ଡ୍ରି ଉଚ୍ଚ ମ୍ୟାଲେରିଆ ପ୍ରବଣତା କ୍ଷେତ୍ରରେ ସେମାନଙ୍କର ପ୍ରଜନନ ଫିଟନେସକୁ ସମର୍ଥନ କରିବା ପାଇଁ ମହିଳାମାନଙ୍କ ପାଇଁ (MISO ର ଉଚ୍ଚ ପ୍ରକାଶନ ମାଧ୍ୟମରେ) ଏକ ଯନ୍ତ୍ରପାତି ପ୍ରଦାନ କରେ, ଯାହା ପରୋକ୍ଷ ଭାବରେ ପ୍ଲାଜମୋଡିୟମ୍ ସଂକ୍ରମଣରେ ଯୋଗଦାନ କରେ। ମହିଳା 20E ମାଈ ଆନୋଫିଲିସ୍ ମଶାରେ P. ଫାଲସିପାରମ୍ ର ବଞ୍ଚିବା ଏବଂ ବୃଦ୍ଧି ଉପରେ ଗଭୀର ପ୍ରଭାବ ପକାଇଥିବା ଦେଖାଯାଇଛି, 24 ପୁରୁଷ ଏବଂ ମହିଳା ଷ୍ଟେରଏଡ୍ ହରମୋନ୍ ପଥ ଉଭୟ ବର୍ତ୍ତମାନ ମଶା-ପରଜୀବୀର ପ୍ରମୁଖ ଦିଗ। ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା।
A. gambiae G3 ପ୍ରଜାତିଗୁଡ଼ିକୁ ମାନକ କୀଟପତଙ୍ଗ ପରିସ୍ଥିତିରେ ପାଳନ କରାଯାଇଥିଲା (26-28 °C, 65-80% ଆପେକ୍ଷିକ ଆର୍ଦ୍ରତା, 12:12 ଘଣ୍ଟା ଆଲୋକ/ଅନ୍ଧକାର ଫଟୋପିରିଅଡ୍)। ଲାର୍ଭାକୁ ପାଉଡର ମାଛ ଖାଦ୍ୟ (ଟେଟ୍ରାମିନ୍ ଟ୍ରପିକାଲ ଫ୍ଲେକ୍ସ, କୋଇ ପେଲେଟ୍ ଏବଂ ଟେଟ୍ରା ପୋଖରୀ ଷ୍ଟିକ୍ସ 7:7:2 ଅନୁପାତରେ) ଖାଇବାକୁ ଦିଆଯାଇଥିଲା। ବୟସ୍କ ମଶାମାନଙ୍କୁ ଆଡ ଲିବିଟମ୍ 10% ଡେକ୍ସଟ୍ରୋଜ୍ ଦ୍ରବଣ ଏବଂ ସାପ୍ତାହିକ ମାନବ ରକ୍ତ (ରକ୍ତ ଉପାଦାନ ଅଧ୍ୟୟନ) ଖୁଆଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା। ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ଦ୍ୱାରା ଶେଷ ଅଂଶ ପରୀକ୍ଷା କରିବା ପରେ ପ୍ୟୁପାଲ୍ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ଲିଙ୍ଗ ପୃଥକ କରି ଭର୍ଜିନ୍ ମଶା ପ୍ରାପ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା। DsRed ଟ୍ରାନ୍ସଜିନ୍ ବହନ କରୁଥିବା ପୁରୁଷମାନଙ୍କୁ ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣନା କରାଯାଇଛି।
ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ ପ୍ରୋଟୋକଲ ଅନୁସାରେ ବଳପୂର୍ବକ ମିଳନ ପରୀକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରାକୃତିକ ମିଳନ ପାଇଁ, 4 ଦିନର କୁମାରୀ ମାଇମାନଙ୍କୁ ଦୁଇ ରାତି ପାଇଁ ଯୌନ ପରିପକ୍ୱ କୁମାରୀ ପୁରୁଷମାନଙ୍କ ସହିତ 1:3 ଅନୁପାତରେ ରଖାଯାଇଥିଲା। ଯେଉଁ ପରୀକ୍ଷଣରେ ପୁରୁଷମାନଙ୍କୁ dsEPP ସହିତ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଆଯାଇଥିଲା, ସେଗୁଡିକ ପାଇଁ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ପରବର୍ତ୍ତୀ 3-4 ଦିନ ସହିତ ସହ-କେଜିଂ ହୋଇଥିଲା, ଯେତେବେଳେ ଫସଫେଟେଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ସର୍ବାଧିକ ନୀରବ କରାଯାଇଥିଲା (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ଚିତ୍ର 2b)।
ମଶା ଟିସୁ, ଶରୀରର ବାକି ଅଂଶ (ଶରୀରର ବାକି ଅଂଶ), କିମ୍ବା ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଶରୀରକୁ 100% ମିଥାନଲରେ ବିଚ୍ଛେଦ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏକ ବିଡର (2 mm ଗ୍ଲାସ ବିଡ୍, 2,400 rpm, 90 ସେକେଣ୍ଡ) ସହିତ ଏକସଙ୍ଗୀକରଣ କରାଯାଇଥିଲା। ଟିସୁ ପରିମାଣ ଏବଂ ମିଥାନଲର ପରିମାଣ ନିମ୍ନଲିଖିତ ଥିଲା: ଶରୀରର ବାକି ଅଂଶ, 1,000 µl ରେ 50; MAG, 50-100 80 µl; ମହିଳା LRT, 25-50 80 µl। ଅବକ୍ଷେପଣକୁ ସମାନ ପରିମାଣର ମିଥାନଲ ସହିତ ଦ୍ୱିତୀୟ ମିଥାନଲ ନିଷ୍କାସନ କରାଯାଇଥିଲା। ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗେସନ୍ ଦ୍ୱାରା କୋଷର ଅବଶେଷ ଅପସାରଣ କରାଯାଇଥିଲା। ଉଭୟ ନିଷ୍କାସନରୁ ମିଥାନଲକୁ ମିଶ୍ରିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ନାଇଟ୍ରୋଜେନ୍ ପ୍ରବାହରେ ଶୁଖାଯାଇଥିଲା, ତାପରେ ପାଣିରେ 80% ମିଥାନଲର ନିମ୍ନଲିଖିତ ପରିମାଣରେ ପୁନଃସ୍ଥାପିତ କରାଯାଇଥିଲା: ଶରୀରର ବାକି ଅଂଶ, 50 µl; MAG ଏବଂ ମହିଳା LRT, 30 µl।
ଏକ LC ଉପକରଣ (Vanquish, Thermo Fisher) ସହିତ ଯୋଡା ହୋଇଥିବା ଏକ ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟର (ID-X, Thermo Fisher) ରେ ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। 5 µl ନମୁନାକୁ 3 µm, 100 × 4.6 mm ସ୍ତମ୍ଭ (Inspirare C8, Dikma) ରେ 25 °C ରେ ରଖାଯାଇଥିଲା। LC ପାଇଁ ମୋବାଇଲ୍ ପର୍ଯ୍ୟାୟଗୁଡ଼ିକ A (ଜଳ, 0.1% ଫର୍ମିକ ଏସିଡ୍) ଏବଂ B (acetonitrile, 0.1% ଫର୍ମିକ ଏସିଡ୍) ଥିଲା। LC ଗ୍ରାଡିଏଣ୍ଟ ନିମ୍ନଲିଖିତ ଭାବରେ ଥିଲା: 1 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 5% B, ତାପରେ 11 ମିନିଟ୍ ମଧ୍ୟରେ 100% B କୁ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଲା। 100% ରେ 8 ମିନିଟ୍ ପରେ, 4 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 5% B ରେ ସ୍ତମ୍ଭକୁ ପୁନଃସନ୍ତୁଳନ କରନ୍ତୁ। ପ୍ରବାହ ହାର 0.3 ml ସର୍ବନିମ୍ନ-1 ଥିଲା। MS ଉତ୍ସରେ ଆୟୋନାଇଜେସନ୍ ସକାରାତ୍ମକ ଏବଂ ନକାରାତ୍ମକ ମୋଡରେ ଗରମ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋସ୍ପ୍ରେ ଆୟନାଇଜେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ସମ୍ପାଦିତ ହୁଏ।
ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟର୍ ପୂର୍ଣ୍ଣ MS ମୋଡ୍‌ରେ 60,000 ରିଜୋଲ୍ୟୁସନ୍‌ରେ 350 ରୁ 680 ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ m/z ରେଞ୍ଜରେ ଡାଟା ମାପ କରେ। [M + H]+ (ସମସ୍ତ ଟାର୍ଗେଟ), [M - H2O + H]+ (ସମସ୍ତ ଟାର୍ଗେଟ), ଏବଂ [M - H]- (ଫସଫୋରିଲେଟେଡ୍ ଟାର୍ଗେଟ) ଉପରେ MS/MS ଡାଟା ଅର୍ଜନ କରାଯାଇଥିଲା। ଟାର୍ଗେଟର ecdysone ଗୁଣଗୁଡ଼ିକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରିବା ପାଇଁ MS/MS ଡାଟା ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା ପାଇଁ କୌଣସି ମାନକ ଉପଲବ୍ଧ ନଥିଲା। ଅଣ-ଲକ୍ଷ୍ୟଯୁକ୍ତ ecdysteroids ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ, 15% ରୁ ଅଧିକ ଆପେକ୍ଷିକ ପ୍ରଚୁରତା ସହିତ ସମସ୍ତ HPLC ଶିଖର ପାଇଁ MS/MS ଡାଟା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ଗୋଟିଏ ପୁରୁଷରେ ମିଳୁଥିବା ପରିମାଣ ସହିତ ସେମାନଙ୍କର ସମାନତା ଗଣନା କରିବା ପାଇଁ ଗୋଟିଏ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ନମୁନା (ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ସମସ୍ତ ଟାର୍ଗେଟ) ର ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ପରିମାଣ କିମ୍ବା ଡାଇଲ୍ୟୁସନ୍ ଗଣନା କରିବା ପାଇଁ ଶୁଦ୍ଧ ମାନକ (20E, 3D20E) ରୁ ସୃଷ୍ଟି ହୋଇଥିବା ମାନକ ବକ୍ର ବ୍ୟବହାର କରି ପରିମାଣକରଣ କରନ୍ତୁ। 3D20E ପାଇଁ, ନିମ୍ନଲିଖିତ ଆସକ୍ତିଗୁଡ଼ିକର ଯୋଗଫଳ ବ୍ୟବହାର କରି ପରିମାଣକରଣ କରାଯାଇଥିଲା: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-।ଟ୍ରାସଫାଇଣ୍ଡର (ସଂସ୍କରଣ 4.1) ବ୍ୟବହାର କରି ତଥ୍ୟ ବାହାର ଏବଂ ପରିମାଣ କରାଯାଇଥିଲା। Xcalibur (ସଂସ୍କରଣ 4.4) ବ୍ୟବହାର କରି MS/MS ତଥ୍ୟ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। E, 20E ଏବଂ 3D20E ର MS ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା ସମ୍ପୃକ୍ତ ମାନକ ସହିତ ତୁଳନା କରାଯାଇଥିଲା। 3D20E22P କୁ Girard ର reagent ସହିତ ଡେରିଭେଟାଇଜେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। 20E22P କୁ m/z ଅନୁପାତ ଦ୍ୱାରା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା।
3D20E22P କୁ MAG ରୁ ବିଶୋଧିତ କରାଯାଇଥିଲା। HPLC-MS/MS ବିଶ୍ଳେଷଣ ପରି ସମାନ LC ପରିସ୍ଥିତିରେ ଏକ କ୍ୱାଡ୍ରୁପୋଲ୍ ମାସ୍-ଆଧାରିତ ଡିଟେକ୍ଟର (QDa, ଆକ୍ୱିଟି, ୱାଟର) ସହିତ ଏକ ଅଲ୍ଟ୍ରା-ପର୍ଫର୍ମାନ୍ସ ଲିକ୍ୱିଡ୍ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫ୍ (Acquity, Waters) ବ୍ୟବହାର କରି ଏକ ବିଶ୍ଳେଷଣାତ୍ମକ ସ୍କେଲରେ ବିଶୋଧନ କରାଯାଇଥିଲା। ପୂର୍ବରୁ ନିର୍ଣ୍ଣିତ ହୋଇଥିବା ସମାନ ଅବଧାରଣ ସମୟରେ 3D20E22P ସହିତ ସମ୍ପର୍କିତ m/z ଚିହ୍ନଟ ହେବା ପରେ ଭଗ୍ନାଂଶ ସଂଗ୍ରହ ଟ୍ରିଗର ହୋଇଥିଲା। ଉପରୋକ୍ତ ବର୍ଣ୍ଣିତ ପରି HPLC-MS/MS ଦ୍ୱାରା ନିଷ୍କାସିତ ଯୌଗିକଗୁଡ଼ିକର ବିଶୁଦ୍ଧତା ଯାଞ୍ଚ କରାଯାଇଥିଲା।
ନିର୍ମାତାଙ୍କ ନିର୍ଦ୍ଦେଶ ଅନୁସରଣ କରି TRI reagent (Thermo Fisher) ବ୍ୟବହାର କରି 10-12 ପ୍ରଜନନ ଟିସୁ କିମ୍ବା ଶରୀରର ଅନ୍ୟ ଅଂଶ (ହେଡଲେସ) ରୁ ମୋଟ RNA ବାହାର କରାଯାଇଥିଲା। RNA କୁ TURBO DNase (Thermo Fisher) ସହିତ ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିଲା। ନିର୍ମାତାଙ୍କ ନିର୍ଦ୍ଦେଶ ଅନୁସରଣ କରି Moloney murine leukemia ଭାଇରସ୍ reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) ବ୍ୟବହାର କରି cDNA ସଂଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ରିଭର୍ସ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ ପରିମାଣାତ୍ମକ PCR (RT-qPCR; ବିସ୍ତାରିତ ଡାଟା ସାରଣୀ 2) ପାଇଁ ପ୍ରାଇମରଗୁଡ଼ିକ ପୂର୍ବରୁ ପ୍ରକାଶିତ ହୋଇଥିଲା24 କିମ୍ବା Primer-BLAST26 ବ୍ୟବହାର କରି ଡିଜାଇନ୍ କରାଯାଇଥିଲା, 70-150 bp ଆକାର ଏବଂ ସ୍ପାନିଂ exon-exon ଜଙ୍କସନ କିମ୍ବା Primer ପେୟାର ପ୍ରାଇମର ପୃଥକ exons ର ଉତ୍ପାଦଗୁଡ଼ିକୁ ପ୍ରାଥମିକତା ଦିଆଯାଇଥିଲା। ତିନି ରୁ ଚାରୋଟି ଜୈବିକ ପ୍ରତିକୃତିରୁ cDNA ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ RT-qPCR ପାଇଁ ପାଣିରେ ଚାରି ଗୁଣ ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା। 1× PowerUp SYBR ଗ୍ରୀନ୍ ମାଷ୍ଟର ମିକ୍ସ (Thermo Fisher), ପ୍ରାଇମର ଏବଂ 5 µl ପିତୁଳା cDNA ଧାରଣ କରୁଥିବା 15 µl ପ୍ରତିକୃତି ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ କ୍ୱାଣ୍ଟିଫିକେସନ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଗୁଡ଼ିକ ଏକ ଉପରେ ଚାଲିଥିଲା। QuantStudio 6 Pro ରିଅଲ୍-ଟାଇମ୍ PCR ସିଷ୍ଟମ୍ (ଥର୍ମୋ ଫିସର) ଏବଂ ତଥ୍ୟ ଡିଜାଇନ୍ ଏବଂ ବିଶ୍ଳେଷଣ (ସଂସ୍କରଣ 2.4.3) ବ୍ୟବହାର କରି ସଂଗ୍ରହ ଏବଂ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ ପ୍ରଦର୍ଶିତ ହୋଇଥିବା ପରି, ଆପେକ୍ଷିକ ପରିମାଣକୁ ରାଇବୋସୋମାଲ ଜିନ୍ RpL19 (AGAP004422) ସହିତ ସ୍ୱାଭାବିକ କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହାର ପ୍ରକାଶନ ରକ୍ତ ପୋଷିବା 27 କିମ୍ବା ମିଳନ 3 ସହିତ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଭାବରେ ପରିବର୍ତ୍ତନ ହୋଇନଥିଲା।
Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) ବ୍ୟବହାର କରି RNA ଗୁଣବତ୍ତା ଯାଞ୍ଚ କରାଯାଇଥିଲା। MIT ଏବଂ ହାର୍ଭାର୍ଡର ବ୍ରଡ ଇନଷ୍ଟିଚ୍ୟୁଟରେ Illumina ପେୟାର-ଏଣ୍ଡ ଲାଇବ୍ରେରୀ ପ୍ରସ୍ତୁତ ଏବଂ ପରିଚାଳିତ ହୋଇଥିଲା। HISAT2 (ସଂସ୍କରଣ 2.0.5) ବ୍ୟବହାର କରି ଡିଫଲ୍ଟ ପାରାମିଟର ସହିତ A. gambiae ଜିନୋମ୍ (PEST ଷ୍ଟ୍ରେନ୍, ସଂସ୍କରଣ 4.12) ସହିତ ସିକୋଏନ୍ସିଂ ରିଡ୍ସକୁ ସଂଯୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା। Samtools (ସଂସ୍କରଣ 1.3.1) ବ୍ୟବହାର କରି ମ୍ୟାପିଂ ଗୁଣବତ୍ତା (MAPQ) ସ୍କୋର ସହିତ <30 ପଠନଗୁଡ଼ିକୁ ଅପସାରଣ କରାଯାଇଥିଲା। ଡିଫଲ୍ଟ ପାରାମିଟର ସହିତ htseq-count (ସଂସ୍କରଣ 0.9.1) ବ୍ୟବହାର କରି ଜିନ୍ ସହିତ ମ୍ୟାପ୍ ହୋଇଥିବା ପଠନ ସଂଖ୍ୟା ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା। R (ସଂସ୍କରଣ 4.0.3) ରେ DESeq2 ପ୍ୟାକେଜ୍ (ସଂସ୍କରଣ 1.28.1) ବ୍ୟବହାର କରି ସାଧାରଣ ପଠନ ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଡିଫରେନ୍ସିଆଲ୍ ଜିନ୍ ପ୍ରକାଶନ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା।
PSI-BLAST ଆଲଗୋରିଦମ (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରଥମେ A. gambiae ଜିନୋମକୁ ଖୋଜି Ecdysone-ପରିବର୍ତ୍ତନକାରୀ ଜିନ୍ ପ୍ରାର୍ଥୀମାନଙ୍କୁ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା। ଡିଫଲ୍ଟ ମୂଲ୍ୟ ବ୍ୟବହାର କରି ନିମ୍ନଲିଖିତ ପ୍ରଶ୍ନ ପ୍ରୋଟିନ୍ କ୍ରମ ସହିତ ପାରାମିଟର: Bombyx mori (Accession No. NP_001038956.1), Musca domestica (Accession No. XP_005182020.1, XP_005175332.1 ଏବଂ XP_011294434.1) ଏବଂ Microplitis demolitor (Accession No. XP_008552646.1 ଏବଂ XP_008552645.1) ରୁ EcK B. mori (Accession No. NP_001036900), Drosophila melanogaster (Accession No. NP_651202), ଆପିସ୍ ମେଲିଫେରା (ଆକ୍ସେସନ୍ ନଂ. XP_394838) ଏବଂ ଆକ୍ସିର୍ଥୋସିଫନ୍ ପିସମ୍ (ଆକ୍ସେସନ୍ ନଂ. XP_001947166); ଏବଂ B. mori (ଆକ୍ସେସନ୍ ନଂ. XP_001947166) NP_001177919.1 ଏବଂ NP_001243996.1) ଏବଂ D. melanogaster (ଆକ୍ସେସନ୍ ନଂ. NP_572986.1) ର EO (ପଦକ୍ଷେପ 1) ରୁ EPP। ପରବର୍ତ୍ତୀ, ଗାମ୍ବିଆରେ ପ୍ରଜନନ ଟିସୁ (ମହିଳା LRT କିମ୍ବା MAG) ରେ ଉଚ୍ଚ mRNA ପ୍ରକାଶନ (> 100 ଖଣ୍ଡ/କିଲୋବେସ୍ ଏକ୍ସନ୍ ପ୍ରତି ମିଲିୟନ ମ୍ୟାପ୍ ହୋଇଥିବା ପାଠ (FPKM) କିମ୍ବା >85%) ଉପରେ ଆଧାରିତ ଫିଲ୍ଟର୍ ହିଟ୍ (ପଦକ୍ଷେପ 2)। ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତାକୁ ଉନ୍ନତ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ପ୍ରାର୍ଥୀ ଏନଜାଇମଗୁଡ଼ିକୁ ଚୟନ କରିଥିଲୁ ଯାହା A. albimanus ର ପ୍ରଜନନ ଟିସୁରେ ମଧ୍ୟ ପ୍ରକାଶିତ ହୁଏ, ଏକ ଆନୋଫିଲିସ୍ ପ୍ରଜାତି ଯାହା ମିଳନ ସମୟରେ ଏକଡିସୋନକୁ ସଂଶ୍ଳେଷଣ କିମ୍ବା ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରେ ନାହିଁ। A. albimanus ପ୍ରଜନନ ଟିସୁ (ପଦକ୍ଷେପ 3) ରେ କମ ପ୍ରକାଶନ (<100 FPKM କିମ୍ବା <85ତମ ଶତକଡା) ଆଧାରରେ ପ୍ରାର୍ଥୀ ଜିନଗୁଡ଼ିକୁ ଫିଲ୍ଟର କରାଯାଇଥିଲା। ଏକ ଚୂଡ଼ାନ୍ତ ଫିଲ୍ଟର (ପଦକ୍ଷେପ 4) ଭାବରେ, ପ୍ରାର୍ଥୀ ଜିନଗୁଡ଼ିକୁ ନିମ୍ନଲିଖିତ ମଧ୍ୟରୁ ଅତି କମରେ ଗୋଟିଏକୁ ସନ୍ତୁଷ୍ଟ କରିବାକୁ ପଡିବ: (1) ଭିନ୍ନକ୍ଷମ ପ୍ରକାଶିତ ଜିନର ବିଶ୍ଳେଷଣ ଅନୁସାରେ ମିଳନ ପରେ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ବୃଦ୍ଧି (P < 0.05) ଏବଂ (2) ଅଣ-ପ୍ରଜନନ ଟିସୁରେ (< 85 % କିମ୍ବା < 100 FPKM)।
ଆମେ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ-ଜୀବ ଆଇସୋଟୋପିକ୍ ଲେବଲିଂ ହାସଲ କରିବା ପାଇଁ ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ ପଦ୍ଧତି 28,29,30 କୁ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରିଥିଲୁ। ସଂକ୍ଷେପରେ, ବନ୍ୟ-ପ୍ରକାର Saccharomyces cerevisiae ପ୍ରକାର II (YSC2, Sigma) ୟେଷ୍ଟ ନାଇଟ୍ରୋଜେନ୍ ବେସ୍ (BD Difco, DF0335) ରେ ପରୀକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା ଯାହା (wt/vol) 2% ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ (G7528, Sigma), 1.7% ଆମିନୋ ଏସିଡ୍-ମୁକ୍ତ ଏବଂ ଆମୋନିୟମ୍ ସଲଫେଟ୍। କଲଚର ମାଧ୍ୟମ) ଏବଂ 5% 15N ଆମୋନିୟମ୍ ସଲଫେଟ୍ (NLM-713, >99%, କେମ୍ବ୍ରିଜ୍ ଆଇସୋଟୋପ୍ ଲାବୋରେଟୋରିଜ୍) ନାଇଟ୍ରୋଜେନ୍ ର ଏକମାତ୍ର ଉତ୍ସ ଭାବରେ ଧାରଣ କରିଥିଲା। ୟେଷ୍ଟକୁ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ପୁନରୁଦ୍ଧାର କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ମଶା ଲାର୍ଭାକୁ ପ୍ୟୁପେସନ୍ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଆଡ୍ ଲିବିଟମ୍ ଖୁଆଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା। ଚତୁର୍ଥ ଇନଷ୍ଟାର ମୃତ୍ୟୁକୁ ରୋକିବା ପାଇଁ ମାଛଖିଆଲ୍ (ପ୍ରତି 300 ଲାର୍ଭାରେ 0.5 ମିଗ୍ରା) ସହିତ ପରିପୂରକ। ମିଳନ ସମୟରେ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ ପୁରୁଷ ପ୍ରୋଟିଓମ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବା ପାଇଁ ଲେବଲ୍ ନଥିବା ପୁରୁଷମାନଙ୍କ ସହିତ ମିଳନ ପରୀକ୍ଷଣରେ କେବଳ ମହିଳାମାନଙ୍କୁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା।
୪-୬ ଦିନ ବୟସର ୧୫N-ଟ୍ୟାଗ୍ ହୋଇଥିବା କୁମାରୀ ମାଇମାନଙ୍କୁ ବୟସ ସହିତ ମେଳ ଖାଉଥିବା ଅଣଟ୍ୟାଗ୍ ହୋଇଥିବା କୁମାରୀ ପୁରୁଷମାନଙ୍କ ସହିତ ମିଳନ କରିବାକୁ ବାଧ୍ୟ କରାଯାଇଥିଲା। ଏପିଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ଅଧୀନରେ ମିଳନ ପ୍ଲଗ୍ ଚିହ୍ନଟ କରି ସଫଳ ମିଳନ ଯାଞ୍ଚ କରାଯାଇଥିଲା। ୩, ୧୨ ଏବଂ ୨୪ hpm ରେ, ୪୫-୫୫ ମିଳନ ହୋଇଥିବା ମାଇମାନଙ୍କର ଆଟ୍ରିଆକୁ ୫୦ µl ଆମୋନିୟମ୍ ବାଇକାର୍ବୋନେଟ୍ ବଫର (pH ୭.୮) ରେ ବିଚ୍ଛିନ୍ନ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏକ ପେଷ୍ଟଲ୍ ସହିତ ସମନ୍ୱିତ କରାଯାଇଥିଲା। ହୋମୋଜେନେଟ୍ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ସୁପରନାଟାଣ୍ଟକୁ ୫୦ µl ୦.୧% ରାପିଗେଷ୍ଟ (୧୮୬୦୦୧୮୬୦, ୱାଟର୍) ସହିତ ୫୦ mM ଆମୋନିୟମ୍ ବାଇକାର୍ବୋନେଟ୍ ରେ ମିଶ୍ରିତ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନାରୁ ସୁପରନାଟାଣ୍ଟ ଏବଂ ପେଲେଟ୍ ଶୁଖିଲା ବରଫ ଉପରେ ସ୍ନାପ୍ ଫ୍ରିଜ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ରାତାରାତି ୱାଶିଂଟନ୍ ବିଶ୍ୱବିଦ୍ୟାଳୟର ମ୍ୟାକକସ୍ ପରୀକ୍ଷାଗାରକୁ ପଠାଯାଇଥିଲା, ଯେଉଁଠାରେ LC-MS/MS ପାଇଁ ନମୁନା ପ୍ରସ୍ତୁତି ସମାପ୍ତ ହୋଇଥିଲା। ପ୍ୟାଲେଟ୍କୁ ୦.୧% ରାପିଗେଷ୍ଟର ୫୦ µl ୫୦ mM ରେ ପୁନଃସ୍ଥାପିତ କରାଯାଇଥିଲା। ଆମୋନିୟମ୍ ବାଇକାର୍ବୋନେଟ୍ ଏବଂ ପାଣି ସ୍ନାନରେ ସୋନିକେଟ୍। BCA ପରୀକ୍ଷା ଦ୍ୱାରା ପେଲେଟ୍ ଏବଂ ସୁପରନାଟାଣ୍ଟର ପ୍ରୋଟିନ୍ ସାନ୍ଦ୍ରତା ମାପ କରାଯାଇଥିଲା, ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ 5 mM ଡିଥିଓଥ୍ରେଇଟଲ୍ (DTT; ସିଗମା) ସହିତ ହ୍ରାସ କରାଯାଇଥିଲା, 15 mM ଆୟୋଡୋଆସେଟାମାଇଡ୍ (ସିଗମା) ସହିତ ଆଲକାଇଲେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଟ୍ରିପ୍ସିନାଇଜେସନ୍ ସହିତ 37 °C (1:0 50) ରେ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା: ଟ୍ରିପ୍ସିନ୍:ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଅନୁପାତ)। RapiGest କୁ 200 mM HCl ଯୋଡି ଲାଇଜ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ତାପରେ 37 °C ରେ 45 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଟେସନ୍ ଏବଂ 14,000 rpm ରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗେସନ୍ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 4 °C ରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଧ୍ୱଂସାବଶେଷ ଅପସାରଣ (Oasis MCX କାର୍ଟ୍ରିଜ୍, ଜଳ) ଦ୍ୱାରା ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା ଏବଂ 0.33 µg µl-1 ର ଅନ୍ତିମ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସାନ୍ଦ୍ରତା ପାଇଁ 0.1% ଫର୍ମିକ ଏସିଡ୍ ରେ ପୁନଃସ୍ଥାପିତ କରାଯାଇଥିଲା। ଲେବଲ୍ ବିହୀନ MAG ପ୍ରୋଟିଓମ୍ କୁ କୁମାରୀ ପୁରୁଷଙ୍କଠାରୁ ସମାନ ଭାବରେ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ଦୁଇଟି ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନା ପାଇଁ ବିଶ୍ଳେଷଣାତ୍ମକ ପ୍ରତିକୃତି ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ, ପ୍ରତ୍ୟେକର 1 μg କୁ 25-ସେମି ଫ୍ୟୁଜଡ୍ ସିଲିକା 75-μm ସ୍ତମ୍ଭ ବ୍ୟବହାର କରି ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା ଯେଉଁଥିରେ ଜୁପିଟର୍ C12 ରିଭର୍ସଡ୍-ଫେଜ୍ ରେଜିନ୍ (ଫେନୋମେନେକ୍ସ) ଏବଂ 180-ମିନିଟ୍ ତରଳ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫି ସହିତ ପ୍ୟାକ୍ ହୋଇଥିବା 4-ସେମି ଫ୍ୟୁଜଡ୍ ସିଲିକା କାସିଲ1 (PQ) ଫ୍ରିଟ୍ ଟ୍ରାପ୍ ଥିଲା। ନମୁନା ଡାଇଜେଷ୍ଟ - MS/MS କୁ ଏକ nanoACQUITY UPLC ସିଷ୍ଟମ (Waters) ସହିତ Q-Exactive HF ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟର (Thermo Fisher) ରେ ଚଲାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରତ୍ୟେକ ରନ୍ ପାଇଁ ସୃଷ୍ଟି ହୋଇଥିବା ଡାଟା-ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ଅଧିଗ୍ରହଣ ଡାଟାକୁ Proteowizard (ସଂସ୍କରଣ 3.0.20287) ବ୍ୟବହାର କରି ଏବଂ Comet31 (ସଂସ୍କରଣ 3.2) ବ୍ୟବହାର କରି FASTA ଡାଟାବେସ୍ ବିରୁଦ୍ଧରେ mzML ଫର୍ମାଟରେ ରୂପାନ୍ତରିତ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା Anopheles gambiae (VectorBase ସଂସ୍କରଣ 54), Anopheles coluzzi ରୁ ପ୍ରୋଟିନ୍ କ୍ରମ ଧାରଣ କରିଥିଲା। Mali-NIH (VectorBase ସଂସ୍କରଣ 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, ମାର୍ଚ୍ଚ 2021), A. gambiae RNA-seq, ଏବଂ ଜଣାଶୁଣା ମାନବ ପ୍ରଦୂଷକଙ୍କ ତିନି-ଫ୍ରେମ୍ ଅନୁବାଦ ଉପରେ ଏକ ସନ୍ଧାନ କରାଯାଇଥିଲା। ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମାନଚିତ୍ର ସହିତ ମେଳ ଖାଉଥିବା FDR ଗୁଡିକୁ Percolator32 (ସଂସ୍କରଣ 3.05) ବ୍ୟବହାର କରି 0.01 ର ଥ୍ରେସହୋଲ୍ଡ ସହିତ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ Limelight33 ରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାର୍ସିମୋନି ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରୋଟିନ୍ ଚିହ୍ନଟକରଣରେ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସକୁ ଏକତ୍ର କରାଯାଇଥିଲା। (ସଂସ୍କରଣ 2.2.0)।ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ ପ୍ରତ୍ୟେକ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାଇଁ ଗଣନା କରାଯାଇଥିବା ସାଧାରଣକୃତ ବର୍ଣ୍ଣାଳ ବହୁଳତା କାରକ (NSAF) ବ୍ୟବହାର କରି ଆପେକ୍ଷିକ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରାଚୁର୍ଯ୍ୟ ଆକଳନ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରତ୍ୟେକ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସାପେକ୍ଷ NSAF ଦୁଇଟି ଭିନ୍ନ ଜୈବିକ ପ୍ରତିକୃତିରୁ ନମୁନା ମଧ୍ୟରେ ହାରାହାରି କରାଯାଇଥିଲା। 15N ଲେବଲ୍ ସଫଳତାର ସହିତ ମହିଳା ପ୍ରୋଟିଓମ୍ କୁ ମାସ୍କ କରିଥିଲା, ଯଦିଓ ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା କୁମାରୀମାନଙ୍କଠାରୁ ଅଳ୍ପ ପରିମାଣର ଅଣଲେବଲ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇପାରିଲା। ଆମେ କେବଳ ବୈଷୟିକ ରନ୍‌ରେ ମହିଳା କଞ୍ଚା ନମୁନାରେ ପୁରୁଷ ପ୍ରୋଟିନ୍ ହ୍ରାସ (1-5 ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା) ଚିହ୍ନଟ ରେକର୍ଡ କରିଛୁ, ଯେଉଁଠାରେ କଞ୍ଚା ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ ପୁରୁଷ/ମିଳନ ନମୁନା ପରେ ଚଲାଯାଉଥିଲା, HPLC "କ୍ୟାରି ଓଭର" ଫଳରେ। ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା କୁମାରୀମାନଙ୍କଠାରୁ 'ଦୂଷକ' ଭାବରେ ମିଳୁଥିବା ବେଳେବେଳେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପରିପୂରକ ସାରଣୀ 1 ରେ ତାଲିକାଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଛି।
ଜେନସ୍କ୍ରିପ୍ଟରେ ଦୁଇଟି ଆଣ୍ଟିଜେନିକ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍, QTTDRVAPAPDQQQ (ଆଇସୋଟାଇପ୍ PA ମଧ୍ୟରେ) ଏବଂ MESDGTTPSGDSEQ (ଆଇସୋଟାଇପ୍ PA ଏବଂ PB ମଧ୍ୟରେ)। ଦୁଇଟି ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମିଶ୍ରିତ ହୋଇଥିଲା, ତା'ପରେ ବାହକ ପ୍ରୋଟିନ୍ KLH ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ନ୍ୟୁଜିଲାଣ୍ଡ ଖରଗୋଶରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଆଯାଇଥିଲା। ଚତୁର୍ଥ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ପରେ ଖରଗୋଶକୁ ବଳି ଦିଆଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ଆଫିନିଟି ପ୍ୟୁରିଫିକେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ମୋଟ IgG ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା। ଅଧିକ ପଶ୍ଚିମ ବ୍ଲଟିଂ ପାଇଁ ସବୁଠାରୁ EPP-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଖରଗୋଶରୁ IgG ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା।
ପଶ୍ଚିମ ବ୍ଲଟ୍ ପାଇଁ, MAG (n = 10, ଯେଉଁଠାରେ n ଜୈବିକ ଭାବରେ ସ୍ୱାଧୀନ ମଶା ନମୁନା ସଂଖ୍ୟାକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ) ଏବଂ 4-ଦିନର କୁମାରୀ ପୁରୁଷ ଏବଂ କୁମାରୀ କିମ୍ବା ବଳପୂର୍ବକ-ମିଳନ ହୋଇଥିବା ମାଈ (<10 ମିଳନ ପରେ), ପ୍ରୋଟିନ୍ ନିଷ୍କାସନ ବଫର (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% ସୋଡିୟମ୍ ଡିଅକ୍ସିକୋଲେଟ୍; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× ପ୍ରୋଟିଜ୍ ଇନହିବିଟର କକଟେଲ (ରୋଚେ)) ପୃଥକ ଭାବରେ ଯୋଡା ଯାଇଥିଲା। ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ ଏକ ବିଡର (2 mm ଗ୍ଲାସ୍ ବିଡ୍ସ, 2,400 rpm, 90 ସେକେଣ୍ଡ) ସହିତ ବିଚ୍ଛେଦ ପରେ ତୁରନ୍ତ ଏକତ୍ରୀକରଣ କରାଯାଇଥିଲା। ଅଦ୍ରବଣୀୟ ଅବଶେଷକୁ 4 °C ରେ 20,000 ଗ୍ରାମ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ଅପସାରିତ କରାଯାଇଥିଲା। ବ୍ରାଡଫୋର୍ଡ ପରୀକ୍ଷା (ବାୟୋ-ରାଡ୍) ଦ୍ୱାରା ପ୍ରୋଟିନ୍ ପରିମାଣ କରାଯାଇଥିଲା। ତା'ପରେ, 20 µg MAG ପ୍ରୋଟିନ୍, 40 µg LRT ପ୍ରୋଟିନ୍, ଏବଂ 20 µg MOPS ବଫର ବ୍ୟବହାର କରି µg ଅବଶିଷ୍ଟ ବଲ୍କ ପ୍ରୋଟିନକୁ 10% Bis-Tris NuPAGE ଦ୍ୱାରା ବିକୃତ ଏବଂ ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା। iBlot2 ସ୍ଥାନାନ୍ତର ପ୍ରଣାଳୀ (ଥର୍ମୋ ଫିସର) ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରୋଟିନଗୁଡ଼ିକୁ ପଲିଭିନାଇଲିଡିନ୍ ଫ୍ଲୋରାଇଡ୍ ମେମ୍ବ୍ରାନକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରାଯାଇଥିଲା। ଝିଲ୍ଲୀଗୁଡ଼ିକୁ 1× PBS-T (PBS ରେ 0.1% Tween-20) ରେ ଦୁଇଥର ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା ଏବଂ ତାପରେ 22°C ରେ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ Odyssey ବ୍ଲକିଂ ବଫର (Li-Cor) ରେ ଅବରୋଧ କରାଯାଇଥିଲା। କଷ୍ଟମ୍ ରାବିଟ୍ ଆଣ୍ଟି-EPP ପଲିକ୍ଲୋନାଲ୍ ପ୍ରାଥମିକ ଆଣ୍ଟିବଡି (ବ୍ଲକିଂ ବଫରରେ 1:700) ଏବଂ ମୂଷା ଆଣ୍ଟି-ଆକ୍ଟିନ୍ ମୋନୋକ୍ଲୋନାଲ୍ ପ୍ରାଥମିକ ଆଣ୍ଟିବଡି MAC237 (Abeam; 1:4,000) ସହିତ ଝିଲ୍ଲୀଗୁଡ଼ିକୁ ରାତାରାତି ହଲାଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା। ଝିଲ୍ଲୀଗୁଡ଼ିକୁ PBS-T ସହିତ ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା ଏବଂ ତାପରେ ଦ୍ୱିତୀୟ ଆଣ୍ଟିବଡି (ଗଧ ଆଣ୍ଟି-ଖରସ 800CW ଏବଂ ଛେଳି ଆଣ୍ଟି-ମୁଷା 680LT (Li-Cor), ଉଭୟ 1:20,000) ସହିତ 0.01% SDS ଏବଂ ଧାରଣ କରିଥିବା ବ୍ଲକିଂ ବଫରରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା। 0.2% ଟୁଇନ୍ -20 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 22°C ରେ। ଝିଲ୍ଲୀଗୁଡ଼ିକୁ PBS-T ସହିତ ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏକ Odyssey CLx ସ୍କାନର ସହିତ ପ୍ରତିଛବି କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରତିଛବିଗୁଡ଼ିକୁ ଇମେଜ୍ ଷ୍ଟୁଡିଓ (ସଂସ୍କରଣ 5.2) ରେ ସଂଗ୍ରହ ଏବଂ ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ କରାଯାଇଥିଲା। EPP-RA ଆଇସୋଫର୍ମ (82 kDa) ସହିତ ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇନଥିଲା।
EPP ର କୋଡିଂ ଅଞ୍ଚଳଗୁଡ଼ିକ (ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ ଫସଫେଟେଜ୍ ଡୋମେନ୍ ଧାରଣ କରୁଥିବା ଆଇସୋଫର୍ମ AGAP002463-RB ଭାବରେ, NCBI ସଂରକ୍ଷିତ ଡୋମେନ୍ ସନ୍ଧାନ 34) ଏବଂ EcK2 (AGAP002181) କୁ pET-21a(+) ପ୍ଲାଜମିଡ୍ (ନୋଭେଜେନ୍ ମିଲିପୋର ସିଗମା) ରେ କ୍ଲୋନ୍ କରାଯାଇଥିଲା; ପ୍ରାଇମରଗୁଡ଼ିକ ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ସାରଣୀ 2 ରେ ତାଲିକାଭୁକ୍ତ। pET-21a(+)-EcK2 ନିର୍ମାଣର C-ଟର୍ମିନାଲ 6xHis ଟ୍ୟାଗ୍ ପୂର୍ବରୁ ଆଠଟି GS4 ଲିଙ୍କର୍ (ଟାଣ୍ଡେମ୍ ରେ) ସନ୍ନିବେଶ କରାଯାଇଥିଲା। NEBExpress କୋଷ-ମୁକ୍ତ E. coli ପ୍ରୋଟିନ୍ ସଂଶ୍ଳେଷଣ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା (New England BioLabs) ବ୍ୟବହାର କରି ପୁନଃସଂସ୍କ୍ରିୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଉତ୍ପାଦନ କରାଯାଇଥିଲା। NEBExpress Ni ସ୍ପିନ୍ ସ୍ତମ୍ଭ (New England BioLabs) ବ୍ୟବହାର କରି ପୁନଃସଂସ୍କ୍ରିୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ବିଶୋଧିତ କରାଯାଇଥିଲା। NEBExpress କୋଷ-ମୁକ୍ତ E. coli ପ୍ରୋଟିନ୍ ସଂଶ୍ଳେଷଣ କିଟ୍ ରୁ DNA ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଡାଇହାଇଡ୍ରୋଫୋଲେଟ୍ ରିଡକ୍ଟେଜ୍ (DHFR) ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଉତ୍ପାଦନ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରୋଟିନ୍ଗୁଡ଼ିକୁ PBS ରେ -20 °C ରେ 3 ​​ମାସ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ 50% ଗ୍ଲିସେରଲରେ ସଂରକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା।
EPP ଏବଂ ଟିସୁ ନିଷ୍କାସନର ଫସଫେଟେଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ 4-ନାଇଟ୍ରୋଫିନାଇଲ୍ ଫସଫେଟ୍ (pNPP; ସିଗମା-ଆଲଡ୍ରିଚ୍) ବ୍ୟବହାର କରି ମାପ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ବଫରରେ 25 mM Tris, 50 mM ଆସେଟିକ୍ ଏସିଡ୍, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, ଏବଂ 1 mM DTT ଥିଲା। ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ବଫରରେ ଟିସୁକୁ ଏକସଙ୍ଗୀକରଣ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗେସନ୍ ଦ୍ୱାରା କୋଷର ଅବଶେଷ ଅପସାରିତ କରାଯାଇଥିଲା। 2.5 mg ml-1 pNPP ଧାରଣ କରିଥିବା ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ବଫରରେ ଏନଜାଇମ୍ କିମ୍ବା ଟିସୁ ନିଷ୍କାସନ ଯୋଡି ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଆରମ୍ଭ କରନ୍ତୁ। ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ମିଶ୍ରଣକୁ ଅନ୍ଧାରରେ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ pNPP ରୁ ପରିବର୍ତ୍ତିତ pNP ପରିମାଣ ବିଭିନ୍ନ ସମୟରେ 405 nm ରେ ଅବଶୋଷଣ ମାପ କରି ପରିମାଣ କରାଯାଇଥିଲା।
ଇନ୍ ଭିଟ୍ରୋ EcK କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ପାଇଁ, ପ୍ରୋଟିନକୁ 0.2 mg 20E କିମ୍ବା 3D20E ସହିତ 200 µl ବଫର (pH 7.5) ରେ 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP ଏବଂ 10 mM MgCl2 ସହିତ 27 °C ରେ 2 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା। 800 µl ମିଥାନଲ ଯୋଡି ପ୍ରତିକ୍ରିୟାକୁ ବନ୍ଦ କରାଯାଇଥିଲା, ତାପରେ -20 °C ରେ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଥଣ୍ଡା କରାଯାଇଥିଲା, ତାପରେ 4 °C ରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 20,000 ଗ୍ରାମ ରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ତାପରେ HPLC-MS/MS ଦ୍ୱାରା ସୁପରନାଟାଣ୍ଟ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଗୋଷ୍ଠୀରେ ବ୍ୟବହୃତ ପ୍ରୋଟିନଗୁଡ଼ିକୁ ଉତ୍ତାପ-ନିଷ୍କ୍ରିୟ କରିବା ପାଇଁ, ପ୍ରୋଟିନଗୁଡ଼ିକୁ 95°C ରେ 20 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ PBS ରେ 50% ଗ୍ଲିସେରଲରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା।
ଇନ୍ ଭିଟ୍ରୋ EPP କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ପାଇଁ, ପ୍ରୋଟିନକୁ 3D20E22P (HPLC-MS/MS ଦ୍ୱାରା ବିଶୁଦ୍ଧ 18 ଯୋଡ଼ା MAG ରେ ମିଳୁଥିବା ପରିମାଣ ସହିତ ସମତୁଲ୍ୟ) ସହିତ 100 μl ବଫର (pH 7.5) ରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଯେଉଁଥିରେ 25 mM Tris, 50 mM ଆସେଟିକ୍ ଏସିଡ୍, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, ଏବଂ 1 mM DTT 27 °C ରେ 3 ​​ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଥିଲା। 400 μl ମିଥାନଲ ଯୋଡି ପ୍ରତିକ୍ରିୟାକୁ ବନ୍ଦ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ -20 °C ରେ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଥଣ୍ଡା କରାଯାଇଥିଲା, ତାପରେ 4 °C ରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 20,000 ଗ୍ରାମ ରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା। HPLC-MS/MS ଦ୍ୱାରା ସୁପରନାଟାଣ୍ଟ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା।
EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) ଏବଂ EcK2 (556 bp) ପାଇଁ PCR ଖଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକୁ ମିଶ୍ରିତ-ଲିଙ୍ଗ ମୁଣ୍ଡବିହୀନ ମଶା ମୃତ ଶରୀରରୁ ପ୍ରସ୍ତୁତ cDNA ରୁ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା। eGFP ନିୟନ୍ତ୍ରଣର PCR ଖଣ୍ଡ (495 bp) ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ pCR2.1-eGFP ରୁ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା; PCR ପ୍ରାଇମରଗୁଡ଼ିକ ବିସ୍ତାରିତ ଡାଟା ସାରଣୀ 2 ରେ ତାଲିକାଭୁକ୍ତ ହୋଇଛି। PCR ଖଣ୍ଡଟି pL4440 ପ୍ଲାଜମିଡରେ ଓଲଟା T7 ପ୍ରମୋଟରମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ସନ୍ନିବେଶିତ ହୋଇଥିଲା। NEB 5-α ସକ୍ଷମ E. coli (ନ୍ୟୁ ଇଂଲଣ୍ଡ ବାୟୋଲାବସ୍) ରୁ ପ୍ଲାଜମିଡ୍ ନିର୍ମାଣଗୁଡ଼ିକ ଉଦ୍ଧାର କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ବ୍ୟବହାର ପୂର୍ବରୁ DNA କ୍ରମ ଦ୍ୱାରା ଯାଞ୍ଚ କରାଯାଇଥିଲା (ସନ୍ନିବେଶ କ୍ରମ ପାଇଁ ପରିପୂରକ ତଥ୍ୟ 1 ଦେଖନ୍ତୁ)। T7 ପ୍ରମୋଟର (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ସାରଣୀ 2) ସହିତ ମେଳ ଖାଉଥିବା ପ୍ରାଇମରଗୁଡ଼ିକୁ pL4440-ଆଧାରିତ ପ୍ଲାଜମିଡରୁ ଇନସର୍ଟକୁ ବୃଦ୍ଧି କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। PCR ଉତ୍ପାଦ ଆକାର ଆଗାରୋଜ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଦ୍ୱାରା ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଥିଲା। dsRNA କୁ Megascript T7 ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ କିଟ୍ (ଥରମୋ ଫିସର) ବ୍ୟବହାର କରି PCR ଟେମ୍ପଲେଟଗୁଡ଼ିକରୁ ଲିପିବଦ୍ଧ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ ପରିବର୍ତ୍ତନ ସହିତ ନିର୍ମାତାଙ୍କ ନିର୍ଦ୍ଦେଶ ଅନୁଯାୟୀ ବିଶୁଦ୍ଧ କରାଯାଇଥିଲା।
dsRNA ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ପାଇଁ, 1,380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) 10 ng nl-1 ସାନ୍ଦ୍ରତାରେ ପ୍ରାପ୍ତବୟସ୍କ ପୁରୁଷ କିମ୍ବା ମହିଳା (Nanoject III, Drummond)ଙ୍କ ବକ୍ଷସ୍ଥଳରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ କରାଯାଇଥିଲା। RNA ନିଷ୍କାସନ, cDNA ସଂଶ୍ଳେଷଣ ଏବଂ RT-qPCR ଦ୍ୱାରା ଅତି କମରେ ତିନୋଟି ଜୈବିକ ପ୍ରତିକୃତିରେ ଜିନ୍ ନକଡାଉନ୍ ସ୍ତର ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା। ecdysone ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ପାଇଁ, 4 ଦିନର କୁମାରୀ କିମ୍ବା 6 ଦିନର କୁମାରୀ ରକ୍ତପୋଷିତ ମହିଳାମାନଙ୍କୁ 0.13, 0.21, କିମ୍ବା 0.63 µg 20E କିମ୍ବା 3D20E (Nanoject III, Drummond) ସହିତ ଯଥାକ୍ରମେ 1.3, 2.1 ସାନ୍ଦ୍ରତାରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା ପରୀକ୍ଷଣିକ ଡିଜାଇନ୍ କିମ୍ବା 6.3 ng nl-1 ଉପରେ ନିର୍ଭର କରି କରାଯାଇଥିଲା। 100 nl 10% (vol/vol) ଇଥାନଲ୍ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ କରାଯାଇଥିଲା। ପାଣିରେ; 10% ଇଥାନଲରେ 100 nl 3D20E22P (ଏକ ଯୋଡା MAG ରେ ମିଳୁଥିବା ପରିମାଣର 75% ସହିତ ସମାନ)। ମଶାମାନଙ୍କୁ ଅନିୟମିତ ଭାବରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଗୋଷ୍ଠୀକୁ ନ୍ୟସ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା।
ଅଣ୍ଡାଦାନ ପରୀକ୍ଷା ପାଇଁ, 3 ଦିନର ମାଈ ମଶାମାନଙ୍କୁ ମଣିଷ ରକ୍ତ ଦେଇ ଆଡ୍ ଲିବିଟମ୍ ଖାଇବାକୁ ଦିଆଯାଇଥିଲା। ଆଂଶିକ ଭାବରେ ଖାଇବାକୁ ଦିଆଯାଇଥିବା କିମ୍ବା ଖାଇବାକୁ ନ ଦିଆଯାଇଥିବା ମଶାମାନଙ୍କୁ ବାହାର କରିଦିଆଯାଇଥିଲା। ଚିକିତ୍ସା ଉପରେ ନିର୍ଭର କରି, ରକ୍ତ ଖାଇବାର ଅତି କମରେ 48 ଘଣ୍ଟା ପରେ ଚାରି ରାତି ପାଇଁ ମାଈ ମଶାମାନଙ୍କୁ ପୃଥକ ଅଣ୍ଡାଦାନ କପରେ ରଖାଯାଇଥିଲା। ଏକ ଷ୍ଟେରିଓସ୍କୋପ୍ (Stemi 508, Zeiss) ଅଧୀନରେ ଅଣ୍ଡା ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା; ମିତ୍ର ହୋଇଥିବା ମାଈ ମଶାମାନଙ୍କ ପାଇଁ, ଲାର୍ଭାରେ ଫୁଟିଥିବା ଅଣ୍ଡାକୁ ପ୍ରଜନନଶୀଳ ବୋଲି ବିବେଚନା କରାଯାଇଥିଲା।
ମିଳନ ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ, ମିଳନ ପ୍ରତି ପ୍ରତିରୋଧ ବିକାଶ କରିବା ପାଇଁ ଚିକିତ୍ସା ଉପରେ ନିର୍ଭର କରି ମହିଳାମାନଙ୍କୁ ଅତି କମରେ 2 ଦିନ ଅନୁମତି ଦିଆଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ବନ୍ୟ-ପ୍ରକାର ବୟସ ସହିତ ମେଳ ଖାଉଥିବା ପୁରୁଷମାନଙ୍କୁ ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ ସମାନ ପିଞ୍ଜରାରେ ପ୍ରବେଶ କରାଯାଇଥିଲା। ଦୁଇ ରାତି ପରେ, ମହିଳା ନିର୍ବୀକୃତ ଭେସିକଲ୍ସକୁ ବିଚ୍ଛେଦ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, ଏବଂ 25 mM NaCl (pH 8.2) ଧାରଣ କରିଥିବା ଏକ ବଫରରେ ଫ୍ରିଜ୍-ଥ ଏବଂ ସୋନିକେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ଜିନୋମିକ୍ DNA ମୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା। ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ 55 °C ରେ 15 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ପ୍ରୋଟିନେଜ୍ K (0.86 µg µl-1) ସହିତ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ତା’ପରେ 95 °C ରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ। ଅଶୋଧିତ ଜିନୋମିକ୍ DNA ପ୍ରସ୍ତୁତିକୁ 10 ଗୁଣ ପତଳା କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ Y କ୍ରୋମୋଜୋମ୍ କ୍ରମର qPCR ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା; ପ୍ରାଇମରଗୁଡ଼ିକୁ ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ସାରଣୀ 2 ରେ ତାଲିକାଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଛି। Y କ୍ରୋମୋଜୋମ୍ କ୍ରମର ଅନୁପସ୍ଥିତି କୌଣସି ମିଳନ ସୂଚାଇଥାଏ।
ପୁନଃ-ମିଟିଂ ପରୀକ୍ଷା ପାଇଁ, ବଳପୂର୍ବକ ମିଟିଂ ହୋଇଥିବା ମହିଳାମାନଙ୍କୁ ମିଟିଂ ସ୍ଥିତି ନିଶ୍ଚିତ କରିବା ପାଇଁ ମେଟିଂ ପ୍ଲଗ୍‌ର ଉପସ୍ଥିତି ପାଇଁ ପରୀକ୍ଷା କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପୁରୁଷମାନଙ୍କ ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ ମିଟିଂ ପାଇଁ ପ୍ରତିସରଣଶୀଳତା ବିକଶିତ କରିବାକୁ 2 ଦିନ ସମୟ ଦିଆଯାଇଥିଲା, ଯେପରି ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣନା କରାଯାଇଛି 36। DsRed ଟ୍ରାନ୍ସଜେନିକ୍ ଶୁକ୍ରାଣୁ ବହନ କରୁଥିବା ପୁରୁଷମାନଙ୍କୁ ତା'ପରେ ମହିଳା ପିଞ୍ଜରାରେ ପ୍ରବେଶ କରାଯାଇଥିଲା। ଦୁଇ ରାତି ପରେ, ମହିଳାମାନଙ୍କଠାରୁ ସାରକାରୀ ଭେସିକଲ୍ସକୁ ବିଚ୍ଛିନ୍ନ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ଉପରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ଅନୁସାରେ ଜିନୋମିକ୍ DNA ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ DsRed ଟ୍ରାନ୍ସଜିନର qPCR ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା; ପ୍ରାଇମରଗୁଡ଼ିକୁ ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ସାରଣୀ 2 ରେ ତାଲିକାଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଛି। DsRed ଟ୍ରାନ୍ସଜିନର ଅନୁପସ୍ଥିତି ସୂଚାଇ ଦେଇଥିଲା ଯେ କୌଣସି ପୁନଃ-ମିଟିଂ ଘଟିନାହିଁ।
3D20E କୁ ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ 37 ଅନୁସାରେ ସଂଶ୍ଳେଷିତ କରାଯାଇଥିଲା। ସଂକ୍ଷେପରେ, 10 ମିଲିଗ୍ରାମ 20E (ସିଗ୍ମା-ଆଲଡ୍ରିଚ୍) 10 ମିଲି ପାଣିରେ ଦ୍ରବୀଭୂତ ହୋଇଥିଲା, ତା’ପରେ 30 ମିଲିଗ୍ରାମ ପ୍ଲାଟିନମ୍ କଳା (ପାଉଡର ଆକାରରେ, ସିଗ୍ମା-ଆଲଡ୍ରିଚ୍) ଯୋଡାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ମିଶ୍ରଣରେ O2 ର ଏକ ମୃଦୁ ଧାରା ନିରନ୍ତର ବବଲ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହାକୁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ହଲାଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା। 6 ଘଣ୍ଟା ପରେ, ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ବନ୍ଦ କରିବା ପାଇଁ 30 ମିଲି ମିଥାନଲ୍ ଯୋଡାଯାଇଥିଲା। ଉତ୍ପ୍ରକାଶକ କଣିକାଗୁଡ଼ିକୁ ବାହାର କରିବା ପାଇଁ ମିଶ୍ରଣକୁ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା। କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ଶୁଷ୍କତା ପାଇଁ ସୁପରନାଟାଣ୍ଟକୁ ବାଷ୍ପୀଭୂତ କରାଯାଇଥିଲା। HPLC-MS/MS ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ପାଇଁ ଶୁଖିଲା ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଉତ୍ପାଦକୁ 10% ଇଥାନଲ୍ ଏବଂ ମିଥାନଲ୍ ରେ ଦ୍ରବୀଭୂତ କରାଯାଇଥିଲା। ରୂପାନ୍ତର ହାର (20E ରୁ 3D20E ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ) ପ୍ରାୟ 97% (ଚିତ୍ର 4b) ଥିଲା, ଏବଂ ସଂଶ୍ଳେଷିତ 3D20E ର MS ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମ୍ ମିଥୁନ ହୋଇଥିବା ମହିଳାମାନଙ୍କ ସହିତ ମେଳ ଖାଉଥିଲା (ଚିତ୍ର 4c)।
କିମ୍ବଦନ୍ତୀରେ କରାଯାଇଥିବା ପରିସଂଖ୍ୟାନ ପରୀକ୍ଷାର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବିବରଣୀ ରହିଛି। ଫିସରଙ୍କ ସଠିକ ପରୀକ୍ଷା, ମାଣ୍ଟେଲ-କକ୍ସ ପରୀକ୍ଷା ଏବଂ ଛାତ୍ରଙ୍କ ଟି-ପରୀକ୍ଷା କରିବା ପାଇଁ ଗ୍ରାଫପ୍ୟାଡ୍ (ସଂସ୍କରଣ 9.0) ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। କୋକ୍ରାନ-ମାଣ୍ଟେଲ-ହେନ୍ସଜେଲ୍ ପରୀକ୍ଷାଗୁଡ଼ିକ ଏକ କଷ୍ଟମ୍ R ସ୍କ୍ରିପ୍ଟ ବ୍ୟବହାର କରି କରାଯାଇଥିଲା (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test ରେ ଉପଲବ୍ଧ)। 0.05 ର ଗୁରୁତ୍ୱ ସୀମା ସହିତ ଶାପିରୋ-ୱିଲ୍କ ପରୀକ୍ଷା ବ୍ୟବହାର କରି ତଥ୍ୟ ବଣ୍ଟନକୁ ସାଧାରଣତା ପାଇଁ ପରୀକ୍ଷା କରାଯାଇଥିଲା। ଯେତେବେଳେ ତଥ୍ୟ ସାଧାରଣତା ପରୀକ୍ଷାରେ ବିଫଳ ହୋଇଥିଲା, ମାନ-ହ୍ୱିଟନି ପରୀକ୍ଷା କରାଯାଇଥିଲା। ମାଣ୍ଟେଲ-କକ୍ସ ପରୀକ୍ଷା ବ୍ୟବହାର କରି ବଞ୍ଚିବା ତଥ୍ୟ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। RNA-seq ଜିନ୍-ସ୍ତରୀୟ ଭିନ୍ନକ୍ଷମ ପ୍ରକାଶନ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବା ପାଇଁ DESeq2 ପ୍ୟାକେଜ୍ (ସଂସ୍କରଣ 1.28.1) ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। ଗ୍ରାଫରେ ଥିବା ଭୂସମାନ୍ତର ବାର୍ ମଧ୍ୟମାକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ। ସମସ୍ତ ପରୀକ୍ଷା ପାଇଁ P = 0.05 ର ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱ ମୂଲ୍ୟ ଥ୍ରେସହୋଲ୍ଡ ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା।
ଅଧ୍ୟୟନ ଡିଜାଇନ୍ ବିଷୟରେ ଅଧିକ ସୂଚନା ପାଇଁ, ଏହି ଆର୍ଟିକିଲ୍ ସହିତ ଲିଙ୍କ୍ ହୋଇଥିବା ପ୍ରକୃତି ଗବେଷଣା ରିପୋର୍ଟ ସାରାଂଶ ଦେଖନ୍ତୁ।
MS ପ୍ରୋଟିଓମିକ୍ ତଥ୍ୟକୁ PRIDE ପାର୍ଟନର ରିପୋଜିଟୋରୀ (https://www.ebi.ac.uk/pride/) ମାଧ୍ୟମରେ ଡାଟାସେଟ୍ ଚିହ୍ନଟକାରୀ PXD032157 ସହିତ ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ରେ ଜମା କରାଯାଇଥିଲା।
RNA-seq ଡାଟାସେଟ୍ ଜିନ୍ ଏକ୍ସପ୍ରେସନ୍ କମ୍ପ୍ରେହେନ୍ସିଭ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) ରେ ସିରିଏଲ୍ ରେକର୍ଡ GSE198665 ଅଧୀନରେ ଜମା ହୋଇଛି।
ବର୍ତ୍ତମାନର ଅଧ୍ୟୟନ ସମୟରେ ସୃଷ୍ଟି ହୋଇଥିବା ଏବଂ/ଅଥବା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିବା ଅତିରିକ୍ତ ଡାଟାସେଟ୍ ଯୁକ୍ତିଯୁକ୍ତ ଅନୁରୋଧ ପରେ ସମ୍ପୃକ୍ତ ଲେଖକମାନଙ୍କଠାରୁ ପ୍ରାପ୍ତ କରାଯାଇପାରିବ। ଏହି ପ୍ରବନ୍ଧଟି ଉତ୍ସ ତଥ୍ୟ ପ୍ରଦାନ କରେ।
ଡି ଲୁଫ୍, ଏ. ଏକଡିଷ୍ଟେରଏଡ୍ସ: ଅବହେଳିତ କୀଟପତଙ୍ଗ ଯୌନ ଷ୍ଟେରଏଡ୍ସ? ପୁରୁଷ: ବ୍ଲାକ୍ ବାକ୍ସ। କୀଟପତଙ୍ଗ ବିଜ୍ଞାନ। ୧୩, ୩୨୫–୩୩୮ (୨୦୦୬)।
ରେଡଫର୍ଣ୍ଣ, CPF 20-ହାଇଡ୍ରୋକ୍ସିଏକ୍ଡାଇସୋନ ଏବଂ ଆନୋଫେଲିସ ଷ୍ଟିଫେନ୍ସରେ ଡିମ୍ବାଶୟ ବିକାଶ। ଜେ। କୀଟ ଶରୀର ବିଜ୍ଞାନ। 28, 97–109 (1982)।