ଇମ୍ୟୁନୋମୋଡୁଲେଟ୍ରି ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ସ ଟ୍ୟୁମର ମାଇକ୍ରୋଏନଭାୟାରମେଣ୍ଟ (TME) ର ଏକ ପ୍ରମୁଖ ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟ, କିନ୍ତୁ କିଛି ବ୍ୟତିକ୍ରମ ସହିତ, ସେମାନଙ୍କର ପରିଚୟ ପ୍ରାୟତଃ ଅଜଣା ରହିଛି। ଏଠାରେ, ଆମେ ଏହି ବିଭିନ୍ନ TME ଅଂଶର ମେଟାବୋଲୋମ୍ ପ୍ରକାଶ କରିବା ପାଇଁ ଉଚ୍ଚ-ଗ୍ରେଡ୍ ସେରସ୍ କାର୍ସିନୋମା (HGSC) ଥିବା ରୋଗୀଙ୍କ ଟ୍ୟୁମର ଏବଂ ଆସାଇଟରୁ ଟ୍ୟୁମର ଏବଂ T କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିଥିଲୁ। ଆସାଇଟ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ବ୍ୟାପକ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ପାର୍ଥକ୍ୟ ଅଛି। ଆସାଇଟ ସହିତ ତୁଳନା କଲେ, ଟ୍ୟୁମର-ଅନୁପ୍ରବେଶକାରୀ T କୋଷଗୁଡ଼ିକ 1-ମିଥାଇଲନିକୋଟିନାମାଇଡ୍ (MNA) ରେ ଯଥେଷ୍ଟ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥାଏ। ଯଦିଓ T କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ MNA ର ସ୍ତର ବୃଦ୍ଧି ପାଇଛି, ନିକୋଟିନାମାଇଡ୍ N-ମିଥାଇଲଟ୍ରାନ୍ସଫେରେଜ୍ (ଏକ ଏନଜାଇମ୍ ଯାହା S-ଆଡେନୋସିଲମେଥିଓନିନ୍ ରୁ ନିକୋଟିନାମାଇଡ୍ କୁ ମିଥାଇଲ ଗୋଷ୍ଠୀର ସ୍ଥାନାନ୍ତରକୁ ଉତ୍ତେଜିତ କରେ) ର ପ୍ରକାଶନ ଫାଇବ୍ରୋବ୍ଲାଷ୍ଟ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର କୋଷ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ସୀମିତ। କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଭାବରେ, MNA ଟ୍ୟୁମର-ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ ସାଇଟୋକାଇନ୍ ଟ୍ୟୁମର ନେକ୍ରୋସିସ୍ ଫ୍ୟାକ୍ଟର ଆଲଫା କ୍ଷରଣ କରିବାକୁ T କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ପ୍ରେରଣା ଦିଏ। ତେଣୁ, TME-ଉତ୍ପନ୍ନ MNA T କୋଷଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରତିରକ୍ଷା ନିୟନ୍ତ୍ରଣରେ ଯୋଗଦାନ କରେ ଏବଂ ମାନବ କର୍କଟ ଚିକିତ୍ସା ପାଇଁ ଏକ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଇମ୍ୟୁନୋଥେରାପି ଲକ୍ଷ୍ୟକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ।
ଟ୍ୟୁମରରୁ ପ୍ରାପ୍ତ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ଟ୍ୟୁମର-ପ୍ରତିରୋଧୀ ଶକ୍ତି ଉପରେ ଗଭୀର ନିରୋଧୀ ପ୍ରଭାବ ପଡ଼ିପାରେ, ଏବଂ ଅଧିକରୁ ଅଧିକ ପ୍ରମାଣ ଦର୍ଶାଉଛି ଯେ ସେମାନେ ରୋଗ ଅଗ୍ରଗତି ପାଇଁ ଏକ ପ୍ରମୁଖ ପ୍ରେରଣାଦାୟକ ଶକ୍ତି ଭାବରେ ମଧ୍ୟ କାର୍ଯ୍ୟ କରିପାରିବେ (1)। ୱାରବର୍ଗ ପ୍ରଭାବ ବ୍ୟତୀତ, ଟ୍ୟୁମର କୋଷଗୁଡ଼ିକର ମେଟାବୋଲିକ୍ ଅବସ୍ଥା ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର ମାଇକ୍ରୋଏନଭାଇରନ୍ମେଣ୍ଟ (TME) ର ପ୍ରତିରୋଧୀ ଅବସ୍ଥା ସହିତ ଏହାର ସମ୍ପର୍କକୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ କରିବା ପାଇଁ ସାମ୍ପ୍ରତିକ କାର୍ଯ୍ୟ ଆରମ୍ଭ ହୋଇଛି। ମାଉସ୍ ମଡେଲ୍ ଏବଂ ମାନବ T କୋଷ ଉପରେ ଅଧ୍ୟୟନରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ଗ୍ଲୁଟାମାଇନ୍ ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ (2), ଅକ୍ସିଡେଟିଭ୍ ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ (3) ଏବଂ ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ (4) ବିଭିନ୍ନ ପ୍ରତିରୋଧୀ କୋଷ ଉପଗୋଷ୍ଠୀ ଉପରେ ସ୍ୱାଧୀନ ଭାବରେ କାର୍ଯ୍ୟ କରିପାରେ। ଏହି ପଥଗୁଡ଼ିକରେ ଥିବା ଅନେକ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍‌ଗୁଡ଼ିକ T କୋଷଗୁଡ଼ିକର ଟ୍ୟୁମର-ପ୍ରତିରୋଧୀ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ବାଧା ଦିଅନ୍ତି। ଏହା ପ୍ରମାଣିତ ହୋଇଛି ଯେ କୋଏନଜାଇମ୍ ଟେଟ୍ରାହାଇଡ୍ରୋବାଇଓପ୍ଟେରିନ୍ (BH4) ର ଅବରୋଧ T କୋଷଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରସାରକୁ କ୍ଷତି ପହଞ୍ଚାଇପାରେ, ଏବଂ ଶରୀରରେ BH4 ର ବୃଦ୍ଧି CD4 ଏବଂ CD8 ଦ୍ୱାରା ମଧ୍ୟସ୍ଥତା ହୋଇଥିବା ଟ୍ୟୁମର-ପ୍ରତିରୋଧୀ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାକୁ ବୃଦ୍ଧି କରିପାରିବ। ଏହା ବ୍ୟତୀତ, BH4 (5) ର ପ୍ରଶାସନ ଦ୍ୱାରା କାଇନୁରେନାଇନ୍‌ର ଇମ୍ମ୍ୟୁନୋସପ୍ରେସିଭ୍ ପ୍ରଭାବକୁ ଉଦ୍ଧାର କରାଯାଇପାରିବ। ଆଇସୋସାଇଟ୍ରେଟ୍ ଡିହାଇଡ୍ରୋଜେନେଜ୍ (IDH) ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ ଗ୍ଲିଓବ୍ଲାଷ୍ଟୋମାରେ, ଏନଆଣ୍ଟିଓମେଟାବୋଲିକ୍ (R)-2-ହାଇଡ୍ରୋକ୍ସିଗ୍ଲୁଟାରେଟ୍ (R-2-HG) ର କ୍ଷରଣ ଟି କୋଷ ସକ୍ରିୟକରଣ, ପ୍ରସାର ଏବଂ ସାଇଟୋଲିସିସ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ବାଧା ଦିଏ (6)। ସମ୍ପ୍ରତି, ଏହା ଦେଖାଯାଇଛି ଯେ ଗ୍ଲାଇକୋଲିସିସ୍ ର ଏକ ଉପ-ଉତ୍ପାଦ ମିଥାଇଲ୍ଗ୍ଲାଇଅକ୍ସାଲ୍, ମାଇଲଏଡ୍ ଉତ୍ପତ୍ତିର ସପ୍ରେସର୍ କୋଷ ଦ୍ୱାରା ଉତ୍ପାଦିତ ହୁଏ, ଏବଂ ମିଥାଇଲ୍ଗ୍ଲାଇଅକ୍ସାଲ୍ ର T କୋଷ ସ୍ଥାନାନ୍ତର ଇଫେକ୍ଟର୍ ଟି କୋଷ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ବାଧା ଦେଇପାରେ। ଚିକିତ୍ସାରେ, ମିଥାଇଲ୍ଗ୍ଲାଇଅକ୍ସାଲ୍ ର ନିରପେକ୍ଷତା ମାଇଲଏଡ୍-ଉତ୍ପନ୍ନ ସପ୍ରେସର୍ କୋଷ (MDSC) ର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ଦୂର କରିପାରିବ ଏବଂ ମାଉସ୍ ମଡେଲ୍ (7) ରେ ଚେକ୍ପଏଣ୍ଟ ବ୍ଲକେଡ୍ ଚିକିତ୍ସାକୁ ସହଭାଗୀ ଭାବରେ ବୃଦ୍ଧି କରିପାରିବ। ଏହି ଅଧ୍ୟୟନଗୁଡ଼ିକ ସାମୂହିକ ଭାବରେ T କୋଷ କାର୍ଯ୍ୟ ଏବଂ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରିବାରେ TME-ଉତ୍ପନ୍ନ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ସର ମୁଖ୍ୟ ଭୂମିକାକୁ ଗୁରୁତ୍ୱ ଦିଏ।
ଡିମ୍ବାଶୟ କର୍କଟ ରୋଗରେ T କୋଷର କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମତା ବହୁଳ ଭାବରେ ରିପୋର୍ଟ କରାଯାଇଛି (8)। ​​ଏହା ଆଂଶିକ ଭାବରେ ହାଇପୋକ୍ସିଆ ଏବଂ ଅସ୍ୱାଭାବିକ ଟ୍ୟୁମର ଭାସ୍କୁଲେଚର (9) ରେ ଅନ୍ତର୍ନିହିତ ମେଟାବୋଲିକ୍ ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟ ଯୋଗୁଁ ହୋଇଛି, ଯାହାର ପରିଣାମ ସ୍ୱରୂପ ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଏବଂ ଟ୍ରିପ୍ଟୋଫାନ୍ ଲାକ୍ଟିକ ଏସିଡ୍ ଏବଂ କାଇନୁରେନିନ୍ ଭଳି ଉପ-ଉତ୍ପାଦରେ ରୂପାନ୍ତରିତ ହୁଏ। ଅତ୍ୟଧିକ ବାହ୍ୟକୋଷୀୟ ଲାକ୍ଟେଟ୍ ଇଣ୍ଟରଫେରନ୍-γ (IFN-γ) ଉତ୍ପାଦନକୁ ହ୍ରାସ କରେ ଏବଂ ମାଏଲୋସପ୍ରେସିଭ୍ ସବଗ୍ରୁପ୍ (10, 11) ର ପାର୍ଥକ୍ୟକୁ ଚାଳିତ କରେ। ଟ୍ରିପ୍ଟୋଫାନ୍ ବ୍ୟବହାର ସିଧାସଳଖ T କୋଷ ପ୍ରସାରକୁ ବାଧା ଦିଏ ଏବଂ T କୋଷ ରିସେପ୍ଟର ସିଗନାଲିଂକୁ ବାଧା ଦିଏ (12-14)। ଏହି ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣ ସତ୍ତ୍ୱେ, ଅପ୍ଟିମାଇଜ୍ଡ ମିଡିଆ ବ୍ୟବହାର କରି ଇନ୍ ଭିଟ୍ରୋ T କୋଷ ସଂସ୍କୃତିରେ ପ୍ରତିରକ୍ଷା ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ବହୁତ କାର୍ଯ୍ୟ କରାଯାଇଥିଲା, କିମ୍ବା ଭିଭୋରେ ହୋମୋଲୋଗସ୍ ମାଉସ୍ ମଡେଲ୍ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ସୀମିତ ଥିଲା, ଯାହା ମଧ୍ୟରୁ କୌଣସିଟି ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଭାବରେ ମାନବ କର୍କଟ ଏବଂ ଶାରୀରିକ ମାକ୍ରୋ ଏବଂ ମାଇକ୍ରୋ ପରିବେଶର ବିଷମତାକୁ ପ୍ରତିଫଳିତ କରେ ନାହିଁ।
ଡିମ୍ବାଶୟ କର୍କଟ ରୋଗର ଏକ ସାଧାରଣ ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟ ହେଉଛି ପେରିଟୋନିଆଲ୍ ବ୍ୟାପିବା ଏବଂ ଆସାଇଟ୍‌ର ଦୃଶ୍ୟ। ଆସାଇଟ୍‌ରେ କୋଷ ତରଳ ପଦାର୍ଥ ଜମା ହେବା ଉନ୍ନତ ରୋଗ ଏବଂ ଖରାପ ପୂର୍ବାନୁମାନ ସହିତ ଜଡିତ (15)। ରିପୋର୍ଟ ଅନୁଯାୟୀ, ଏହି ଅନନ୍ୟ ଅଂଶ ହାଇପକ୍ସିକ, ଏଥିରେ ଭାସ୍କୁଲାର୍ ଏଣ୍ଡୋଥେଲିଆଲ୍ ବୃଦ୍ଧି ଫ୍ୟାକ୍ଟର (VEGF) ଏବଂ ଇଣ୍ଡୋଲିଆମାଇନ୍ 2,3-ଡାଇଅକ୍ସିଜେନେଜ୍ (IDO) ର ଉଚ୍ଚ ସ୍ତର ଅଛି, ଏବଂ ଏହା T ନିୟାମକ କୋଷ ଏବଂ ମାଇଲଏଡ୍ ନିରୋଧୀ କୋଷ (15-18) ଦ୍ୱାରା ଅନୁପ୍ରବେଶିତ। ଆସାଇଟ୍‌ର ମେଟାବୋଲିକ୍ ପରିବେଶ ଟ୍ୟୁମରଠାରୁ ଭିନ୍ନ ହୋଇପାରେ, ତେଣୁ ପେରିଟୋନିଆଲ୍ ସ୍ଥାନରେ T କୋଷଗୁଡ଼ିକର ପୁନଃପ୍ରୋଗ୍ରାମିଂ ଅସ୍ପଷ୍ଟ। ଏହା ବ୍ୟତୀତ, ଟ୍ୟୁମର ପରିବେଶରେ ଉପସ୍ଥିତ ଆସାଇଟ୍ ଏବଂ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍‌ ମଧ୍ୟରେ ମୁଖ୍ୟ ପାର୍ଥକ୍ୟ ଏବଂ ବିଷମତା ପ୍ରତିରକ୍ଷା କୋଷଗୁଡ଼ିକର ଅନୁପ୍ରବେଶ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର ଉପରେ ସେମାନଙ୍କର କାର୍ଯ୍ୟକୁ ବାଧା ଦେଇପାରେ, ଏବଂ ଅଧିକ ଗବେଷଣା ଆବଶ୍ୟକ।
ଏହି ସମସ୍ୟାଗୁଡ଼ିକର ସମାଧାନ ପାଇଁ, ଆମେ ବିଭିନ୍ନ କୋଷ ପ୍ରକାର (CD4 + ଏବଂ CD8 + T କୋଷ ସମେତ) ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର ମଧ୍ୟରେ ଏବଂ ମଧ୍ୟରେ ଅଧ୍ୟୟନ କରିବା ପାଇଁ ଏକ ସମ୍ବେଦନଶୀଳ କୋଷ ପୃଥକୀକରଣ ଏବଂ ତରଳ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫି ଟାଣ୍ଡେମ୍ ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି (LC-MS/MS) ପଦ୍ଧତି ଡିଜାଇନ୍ କରିଛୁ। ଏହାର ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ରୋଗୀର ସମାନ ଆସାଇଟ୍ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର ପରିବେଶରେ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ବ୍ୟାପନ୍ତି। ଆମେ ଏହି ପ୍ରମୁଖ ଜନସଂଖ୍ୟାର ମେଟାବୋଲିକ୍ ସ୍ଥିତିର ଏକ ଉଚ୍ଚ ସମାଧାନିତ ପୋର୍ଟ୍ରେଟ୍ ପ୍ରଦାନ କରିବା ପାଇଁ ଉଚ୍ଚ-ଡାଇମେନ୍ସନାଲ୍ ପ୍ରବାହ ସାଇଟୋମେଟ୍ରି ଏବଂ ଏକକ-କୋଷ RNA ସିକୋଇନ୍ସିଂ (scRNA-seq) ସହିତ ମିଳିତ ଭାବରେ ଏହି ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରୁ। ଏହି ପଦ୍ଧତି ଟ୍ୟୁମର T କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ 1-ମିଥାଇଲନିକୋଟିନାମାଇଡ୍ (MNA) ସ୍ତରର ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ବୃଦ୍ଧି ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲା, ଏବଂ ଇନ୍ ଭିଟ୍ରୋ ପରୀକ୍ଷଣ ଦେଖାଇଥିଲା ଯେ T କୋଷ କାର୍ଯ୍ୟ ଉପରେ MNA ର ଇମ୍ୟୁନୋମୋଡୁଲେଟ୍ରି ପ୍ରଭାବ ପୂର୍ବରୁ ଅଜ୍ଞାତ ଥିଲା। ସାଧାରଣତଃ, ଏହି ପଦ୍ଧତି ଟ୍ୟୁମର ଏବଂ ଇମ୍ୟୁନୋ କୋଷ ମଧ୍ୟରେ ପାରସ୍ପରିକ ମେଟାବୋଲିକ୍ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ପ୍ରକାଶ କରେ, ଏବଂ ଇମ୍ୟୁନୋ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ବିଷୟରେ ଅନନ୍ୟ ଅନ୍ତର୍ଦୃଷ୍ଟି ପ୍ରଦାନ କରେ, ଯାହା T କୋଷ-ଆଧାରିତ ଡିମ୍ବାଶୟ କର୍କଟ ଇମ୍ୟୁନୋଥେରାପି ଚିକିତ୍ସା ସୁଯୋଗ ପାଇଁ ଉପଯୋଗୀ ହୋଇପାରେ।
ଆମେ ଏକକାଳୀନ ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଗ୍ରହଣ ପରିମାଣ ପାଇଁ ଉଚ୍ଚ-ପରିମାଣ ପ୍ରବାହ ସାଇଟୋମେଟ୍ରି ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) ଏବଂ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) ହେଉଛି ପାର୍ଶ୍ଵବର୍ତ୍ତୀ ସାଧାରଣ ମାର୍କର ଯାହା ପ୍ରତିରକ୍ଷା କୋଷ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର କୋଷ ଜନସଂଖ୍ୟାକୁ ପୃଥକ କରିଥାଏ (ସାରଣୀ S2 ଏବଂ ଚିତ୍ର S1A)। ଏହି ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦେଖାଇଛି ଯେ T କୋଷ ତୁଳନାରେ, ଆସାଇଟ୍ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର କୋଷଗୁଡିକରେ ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଗ୍ରହଣ ସ୍ତର ଅଧିକ ଥାଏ, କିନ୍ତୁ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପରେ କମ୍ ପାର୍ଥକ୍ୟ ଥାଏ। ଟ୍ୟୁମର କୋଷଗୁଡିକର ହାରାହାରି ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଗ୍ରହଣ [CD45-EpCAM (EpCAM)+] T କୋଷଗୁଡିକର ହାରାହାରି ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଗ୍ରହଣ ତୁଳନାରେ ତିନିରୁ ଚାରି ଗୁଣ, ଏବଂ CD4 + T କୋଷଗୁଡିକର ହାରାହାରି ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଗ୍ରହଣ ତୁଳନାରେ CD8 + T କୋଷଗୁଡିକର 1.2 ଗୁଣ, ଯାହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ ଟ୍ୟୁମର ଅନୁପ୍ରବେଶକାରୀ ଲିମ୍ଫୋସାଇଟସ୍ (TIL) ସମାନ TME (ଚିତ୍ର 1A) ରେ ମଧ୍ୟ ଭିନ୍ନ ମେଟାବୋଲିକ୍ ଆବଶ୍ୟକତା ରହିଛି। ବିପରୀତରେ, ଟ୍ୟୁମର କୋଷଗୁଡିକରେ ମାଇଟୋକୋଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ CD4 + T କୋଷଗୁଡିକ ସହିତ ସମାନ, ଏବଂ ଉଭୟ କୋଷ ପ୍ରକାରର ମାଇଟୋକୋଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ CD8 + T କୋଷଗୁଡିକ ଅପେକ୍ଷା ଅଧିକ (ଚିତ୍ର 1B)। ସାଧାରଣତଃ, ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକ ମେଟାବୋଲିକ୍ ସ୍ତର ପ୍ରକାଶ କରେ। ଟ୍ୟୁମର କୋଷଗୁଡିକର ମେଟାବୋଲିକ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ CD4 + T କୋଷଗୁଡିକ ଅପେକ୍ଷା ଅଧିକ, ଏବଂ CD4 + T କୋଷଗୁଡିକର ମେଟାବୋଲିକ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ CD8 + T କୋଷଗୁଡିକ ଅପେକ୍ଷା ଅଧିକ। କୋଷ ପ୍ରକାର ମଧ୍ୟରେ ଏହି ପ୍ରଭାବ ସତ୍ତ୍ୱେ, ଟ୍ୟୁମର ତୁଳନାରେ CD4 + ଏବଂ CD8 + T କୋଷଗୁଡିକର ମେଟାବୋଲିକ୍ ସ୍ଥିତି କିମ୍ବା ଆସାଇଟରେ ସେମାନଙ୍କର ଆପେକ୍ଷିକ ଅନୁପାତରେ କୌଣସି ସ୍ଥିର ପାର୍ଥକ୍ୟ ନାହିଁ (ଚିତ୍ର 1C)। ବିପରୀତରେ, CD45-କୋଷ ଭଗ୍ନାଂଶରେ, ଆସାଇଟଗୁଡିକ ତୁଳନାରେ ଟ୍ୟୁମରରେ EpCAM+ କୋଷଗୁଡିକର ଅନୁପାତ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଛି (ଚିତ୍ର 1D)। ଆମେ EpCAM+ ଏବଂ EpCAM- କୋଷ ଉପାଦାନଗୁଡିକ ମଧ୍ୟରେ ଏକ ସ୍ପଷ୍ଟ ମେଟାବୋଲିକ୍ ପାର୍ଥକ୍ୟ ମଧ୍ୟ ଦେଖିଲୁ। EpCAM+ (ଟ୍ୟୁମର) କୋଷଗୁଡିକରେ EpCAM- କୋଷଗୁଡିକ ଅପେକ୍ଷା ଅଧିକ ଗ୍ଲୁକୋଜ ଗ୍ରହଣ ଏବଂ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଥାଏ, ଯାହା TME (ଚିତ୍ର 1, E ଏବଂ F) ରେ ଟ୍ୟୁମର କୋଷଗୁଡିକରେ ଫାଇବ୍ରୋବ୍ଲାଷ୍ଟର ମେଟାବୋଲିକ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଅପେକ୍ଷା ବହୁତ ଅଧିକ।
(A ଏବଂ B) ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଗ୍ରହଣର ମଧ୍ୟମା ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ତୀବ୍ରତା (MFI) (2-NBDG) (A) ଏବଂ CD4 + T କୋଷର ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ (MitoTracker ଗାଢ଼ ଲାଲ) (B) ପ୍ରତିନିଧି ଗ୍ରାଫ୍ (ବାମ) ଏବଂ ଟେବୁଲେଟେଡ୍ ତଥ୍ୟ (ଡାହାଣ), ଜଲା ଏବଂ ଟ୍ୟୁମରରୁ CD8 + T କୋଷ ଏବଂ EpCAM + CD45-ଟ୍ୟୁମର କୋଷ। (C) ଜଲା ଏବଂ ଟ୍ୟୁମରରେ CD4 + ଏବଂ CD8 + କୋଷ (CD3 + T କୋଷର)ର ଅନୁପାତ। (D) ଜଲା ଏବଂ ଟ୍ୟୁମରରେ EpCAM + ଟ୍ୟୁମର କୋଷର ଅନୁପାତ (CD45−)। (E ଏବଂ F) EpCAM + CD45-ଟ୍ୟୁମର ଏବଂ EpCAM-CD45-ମାଟ୍ରିକ୍ସ ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଗ୍ରହଣ (2-NBDG) (E) ଏବଂ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ (MitoTracker ଗାଢ଼ ଲାଲ) (F) ପ୍ରତିନିଧି ଗ୍ରାଫ୍ (ବାମ) ଏବଂ ଟେବୁଲେଟେଡ୍ ତଥ୍ୟ (ଡାହାଣ) ଜଲା ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର କୋଷ। (G) ପ୍ରବାହ ସାଇଟୋମେଟ୍ରି ଦ୍ୱାରା CD25, CD137 ଏବଂ PD1 ପ୍ରକାଶନର ପ୍ରତିନିଧି ଗ୍ରାଫ୍। (H ଏବଂ I) CD4 + T କୋଷ (H) ଏବଂ CD8 + T କୋଷ (I) ଉପରେ CD25, CD137 ଏବଂ PD1 ପ୍ରକାଶନ। (J ଏବଂ K) CCR7 ଏବଂ CD45RO ର ପ୍ରକାଶନ ଉପରେ ଆଧାରିତ ନିଷ୍କ୍ରିୟ, କେନ୍ଦ୍ରୀୟ ମେମୋରୀ (Tcm), ପ୍ରଭାବକ (Teff) ଏବଂ ପ୍ରଭାବକ ମେମୋରୀ (Tem) ଫେନୋଟାଇପ୍। ଆସାଇଟ୍ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମରରେ CD4 + T କୋଷ (J) ଏବଂ CD8 + T କୋଷ (K) ର ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପ୍ରତିଛବି (ବାମ) ଏବଂ ସାରଣୀ ତଥ୍ୟ (ଡାହାଣ)। ଯୋଡା ଟି-ପରୀକ୍ଷା (*P<0.05, **P<0.01 ଏବଂ ***P<0.001) ଦ୍ୱାରା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିବା P ମୂଲ୍ୟ। ରେଖା ମେଳ ଖାଉଥିବା ରୋଗୀଙ୍କୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ (n = 6)। FMO, ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ମାଇନସ୍ ୱାନ୍; MFI, ମଧ୍ୟମା ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ତୀବ୍ରତା।
ଅଧିକ ବିଶ୍ଳେଷଣରୁ ଅତ୍ୟନ୍ତ ସମାଧାନ ହୋଇଥିବା T କୋଷ ଫେନୋଟାଇପିକ୍ ସ୍ଥିତି ମଧ୍ୟରେ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପାର୍ଥକ୍ୟ ପ୍ରକାଶ ପାଇଲା। ଟ୍ୟୁମରରେ ସକ୍ରିୟ (ଚିତ୍ର 1, G ରୁ I) ଏବଂ ପ୍ରଭାବକ ମେମୋରୀ (ଚିତ୍ର 1, J ଏବଂ K) ଆସାଇଟ୍ (CD3 + T କୋଷର ଅନୁପାତ) ତୁଳନାରେ ବହୁତ ଅଧିକ ଦେଖାଯାଏ। ସେହିପରି, ସକ୍ରିୟକରଣ ମାର୍କର (CD25 ଏବଂ CD137) ଏବଂ ହ୍ରାସ ମାର୍କର [ପ୍ରୋଗ୍ରାମଡ୍ କୋଷ ଡେଥ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ 1 (PD1)] ର ପ୍ରକାଶନ ଦ୍ୱାରା ଫେନୋଟାଇପ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରି ଦେଖାଗଲା ଯେ ଯଦିଓ ଏହି ଜନସଂଖ୍ୟାର ମେଟାବୋଲିକ୍ ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ଭିନ୍ନ (ଚିତ୍ର S1, B ରୁ E), କିନ୍ତୁ ନିଷ୍କ୍ରିୟ, ପ୍ରଭାବକ କିମ୍ବା ମେମୋରୀ ସବସେଟ୍ (ଚିତ୍ର S1, F ରୁ I) ମଧ୍ୟରେ କୌଣସି ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ମେଟାବୋଲିକ୍ ପାର୍ଥକ୍ୟ ସ୍ଥିର ଭାବରେ ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇନାହିଁ। ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକୁ ସ୍ୱୟଂଚାଳିତ ଭାବରେ କୋଷ ଫେନୋଟାଇପ୍ (21) ନ୍ୟସ୍ତ କରିବା ପାଇଁ ମେସିନ୍ ଲର୍ନିଂ ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରି ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା ରୋଗୀଙ୍କ ଆସାଇଟ୍ (ଚିତ୍ର S2A) ରେ ବହୁ ସଂଖ୍ୟକ ଅସ୍ଥି ମଜ୍ଜା କୋଷ (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ର ଉପସ୍ଥିତି ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲା। ସମସ୍ତ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା କୋଷ ପ୍ରକାର ମଧ୍ୟରେ, ଏହି ମାଇଲଏଡ୍ କୋଷ ଜନସଂଖ୍ୟା ସର୍ବାଧିକ ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଗ୍ରହଣ ଏବଂ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଦେଖାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର S2, B ରୁ G)। ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକ HGSC ରୋଗୀଙ୍କଠାରେ ଆସାଇଟ୍ସ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମରରେ ମିଳୁଥିବା ଏକାଧିକ କୋଷ ପ୍ରକାର ମଧ୍ୟରେ ଦୃଢ଼ ମେଟାବୋଲିକ୍ ପାର୍ଥକ୍ୟକୁ ଉଜ୍ଜ୍ୱଳ କରିଥାଏ।
TIL ର ମେଟାବୋନୋମିକ୍ ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟଗୁଡ଼ିକୁ ବୁଝିବାରେ ମୁଖ୍ୟ ଚ୍ୟାଲେଞ୍ଜ ହେଉଛି ଟ୍ୟୁମରରୁ ପର୍ଯ୍ୟାପ୍ତ ଶୁଦ୍ଧତା, ଗୁଣବତ୍ତା ଏବଂ ପରିମାଣର T କୋଷ ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ ପୃଥକ କରିବାର ଆବଶ୍ୟକତା। ସାମ୍ପ୍ରତିକ ଅଧ୍ୟୟନରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ପ୍ରବାହ ସାଇଟୋମେଟ୍ରି ଉପରେ ଆଧାରିତ ସଜାଡ଼ିବା ଏବଂ ମଣି ସମୃଦ୍ଧି ପଦ୍ଧତିଗୁଡ଼ିକ କୋଷୀୟ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ପ୍ରୋଫାଇଲରେ ପରିବର୍ତ୍ତନ ଆଣିପାରେ (22-24)। ଏହି ସମସ୍ୟାକୁ ଦୂର କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ LC-MS/MS ଦ୍ୱାରା ବିଶ୍ଳେଷଣ ପୂର୍ବରୁ ଅସ୍ତ୍ରୋପଚାର ଦ୍ୱାରା ପୁନଃସଂଗ୍ରହିତ ମାନବ ଡିମ୍ବାଶୟ କର୍କଟରୁ TIL କୁ ପୃଥକ ଏବଂ ପୃଥକ କରିବା ପାଇଁ ମଣି ସମୃଦ୍ଧି ପଦ୍ଧତିକୁ ଅପ୍ଟିମାଇଜ୍ କରିଛୁ (ଉପାଦାନ ଏବଂ ପଦ୍ଧତି ଦେଖନ୍ତୁ; ଚିତ୍ର 2A)। ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ପରିବର୍ତ୍ତନ ଉପରେ ଏହି ପ୍ରୋଟୋକଲର ସାମଗ୍ରିକ ପ୍ରଭାବ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ଉପରୋକ୍ତ ମଣି ପୃଥକୀକରଣ ପଦକ୍ଷେପ ପରେ ସୁସ୍ଥ ଦାତାମାନଙ୍କ ଦ୍ୱାରା ସକ୍ରିୟ ହୋଇଥିବା T କୋଷଗୁଡ଼ିକର ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ପ୍ରୋଫାଇଲଗୁଡ଼ିକୁ ସେହି କୋଷଗୁଡ଼ିକ ସହିତ ତୁଳନା କରିଛୁ ଯାହା ମଣି ପୃଥକ କରାଯାଇ ନଥିଲା କିନ୍ତୁ ବରଫ ଉପରେ ରହିଥିଲା। ଏହି ଗୁଣବତ୍ତା ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ବିଶ୍ଳେଷଣରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ଏହି ଦୁଇଟି ଅବସ୍ଥା (r = 0.77) ମଧ୍ୟରେ ଏକ ଉଚ୍ଚ ସମ୍ପର୍କ ଅଛି, ଏବଂ 86 ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ଗୋଷ୍ଠୀର ବୈଷୟିକ ପୁନରାବୃତ୍ତି କ୍ଷମତା ଉଚ୍ଚ ପୁନରାବୃତ୍ତି କ୍ଷମତା (ଚିତ୍ର 2B) ରହିଛି। ତେଣୁ, ଏହି ପଦ୍ଧତିଗୁଡ଼ିକ କୋଷ ପ୍ରକାର ସମୃଦ୍ଧି ଅଧୀନରେ ଥିବା କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ସଠିକ୍ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିପାରିବ, ଏହିପରି HGSCରେ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ ପ୍ରଥମ ଉଚ୍ଚ-ସଂଶୋଧନ ପ୍ଲାଟଫର୍ମ ପ୍ରଦାନ କରେ, ଯାହାଦ୍ୱାରା ଲୋକମାନେ କୋଷ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଯୌନ ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ରମ ବିଷୟରେ ଗଭୀର ବୁଝାମଣା ହାସଲ କରିପାରିବେ।
(A) ଚୁମ୍ବକୀୟ ମଣି ସମୃଦ୍ଧିର ଯୋଜନାବଦ୍ଧ ଚିତ୍ର। LC-MS/MS ଦ୍ୱାରା ବିଶ୍ଳେଷଣ ପୂର୍ବରୁ, କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଚୁମ୍ବକୀୟ ମଣି ସମୃଦ୍ଧିର କ୍ରମାଗତ ତିନୋଟି ରାଉଣ୍ଡ ଦେଇଯିବେ କିମ୍ବା ବରଫ ଉପରେ ରହିବେ। (B) ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ସର ପ୍ରଚୁରତା ଉପରେ ସମୃଦ୍ଧିର ପ୍ରକାରର ପ୍ରଭାବ। ପ୍ରତ୍ୟେକ ସମୃଦ୍ଧିର ପ୍ରକାର ± SE ପାଇଁ ତିନୋଟି ମାପର ହାରାହାରି। ଧୂସର ରେଖା ଏକ 1:1 ସମ୍ପର୍କକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ। ଅକ୍ଷ ଲେବଲରେ ଦର୍ଶାଯାଇଥିବା ପୁନରାବୃତ୍ତି ମାପର ଅନ୍ତଃ-ଶ୍ରେଣୀ ସହସଂଯୋଗ (ICC)। NAD, ନିକୋଟିନାମାଇଡ୍ ଆଡେନାଇନ୍ ଡାଇନୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍। (C) ରୋଗୀ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣର କାର୍ଯ୍ୟପ୍ରବାହର ଯୋଜନାବଦ୍ଧ ଚିତ୍ର। ରୋଗୀଙ୍କଠାରୁ ଆସାଇଟ୍ କିମ୍ବା ଟ୍ୟୁମର ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଏ ଏବଂ କ୍ରାଇଓପ୍ରିଜର୍ଭ କରାଯାଏ। ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନାର ଏକ ଛୋଟ ଅଂଶ ପ୍ରବାହ ସାଇଟୋମେଟ୍ରି ଦ୍ୱାରା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା, ଯେତେବେଳେ ଅବଶିଷ୍ଟ ନମୁନାଗୁଡ଼ିକ CD4+, CD8+ ଏବଂ CD45- କୋଷ ପାଇଁ ସମୃଦ୍ଧିର ତିନି ରାଉଣ୍ଡ ଦେଇଯାଇଥିଲା। ଏହି କୋଷ ଭଗ୍ନାଂଶଗୁଡ଼ିକୁ LC-MS/MS ବ୍ୟବହାର କରି ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। (D) ମାନକୀକୃତ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ପ୍ରାଚୁର୍ଯ୍ୟର ତାପ ମାନଚିତ୍ର। ଡେଣ୍ଡ୍ରୋଗ୍ରାମ ନମୁନା ମଧ୍ୟରେ ୟୁକ୍ଲିଡିଆନ୍ ଦୂରତାର ୱାର୍ଡର କ୍ଲଷ୍ଟରିଂକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ। (E) ନମୁନା ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ମାନଚିତ୍ରର ମୁଖ୍ୟ ଉପାଦାନ ବିଶ୍ଳେଷଣ (PCA), ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନାର ତିନୋଟି ପ୍ରତିକୃତି ଦେଖାଉଛି, ସମାନ ରୋଗୀଙ୍କ ନମୁନାଗୁଡ଼ିକ ଏକ ରେଖା ଦ୍ୱାରା ସଂଯୁକ୍ତ। (F) ରୋଗୀ ଉପରେ ସର୍ତ୍ତିତ ନମୁନାର ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ପ୍ରୋଫାଇଲର PCA (ଯଥା, ଆଂଶିକ ରିଡାଣ୍ଡେନ୍ସୀ ବ୍ୟବହାର କରି); ନମୁନା ପ୍ରକାର ଉତ୍ତଳ ହୁଲ୍ ଦ୍ୱାରା ସୀମିତ। PC1, ମୁଖ୍ୟ ଉପାଦାନ 1; PC2, ମୁଖ୍ୟ ଉପାଦାନ 2।
ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ, ଆମେ ଛଅ ଜଣ HGSC ରୋଗୀଙ୍କ ପ୍ରାଥମିକ ଜଲା ଏବଂ ଟ୍ୟୁମରରେ CD4 +, CD8 + ଏବଂ CD45-କୋଷ ଭଗ୍ନାଂଶରେ 99 ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବା ପାଇଁ ଏହି ସମୃଦ୍ଧି ପଦ୍ଧତି ପ୍ରୟୋଗ କରିଥିଲୁ (ଚିତ୍ର 2C, ଚିତ୍ର S3A ଏବଂ ସାରଣୀ S3 ଏବଂ S4)। ଜୀବନ୍ତ କୋଷର ମୂଳ ବଡ଼ ନମୁନାର 2% ରୁ 70% ପାଇଁ ଆଗ୍ରହର ଜନସଂଖ୍ୟା, ଏବଂ ରୋଗୀମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ କୋଷର ଅନୁପାତ ବହୁତ ଭିନ୍ନ ହୋଇଥାଏ। ମଣିଗୁଡ଼ିକୁ ପୃଥକ କରିବା ପରେ, ସମୃଦ୍ଧି ଅଂଶ (CD4+, CD8+ କିମ୍ବା CD45-) ନମୁନାରେ ସମସ୍ତ ଜୀବନ୍ତ କୋଷର ହାରାହାରି 85% ରୁ ଅଧିକ ପାଇଁ ଆଗ୍ରହର ଅଂଶ। ଏହି ସମୃଦ୍ଧି ପଦ୍ଧତି ଆମକୁ ମାନବ ଟ୍ୟୁମର ଟିସୁ ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ ରୁ କୋଷ ଜନସଂଖ୍ୟା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ, ଯାହା ବଡ଼ ନମୁନାରୁ କରିବା ଅସମ୍ଭବ। ଏହି ପ୍ରୋଟୋକଲ ବ୍ୟବହାର କରି, ଆମେ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିଥିଲୁ ଯେ l-kynurenine ଏବଂ adenosine, ଏହି ଦୁଇଟି ଭଲ ଭାବରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ଇମ୍ୟୁନୋସପ୍ରେସିଭ୍ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ଟ୍ୟୁମର T କୋଷ କିମ୍ବା ଟ୍ୟୁମର କୋଷରେ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର S3, B ଏବଂ C)। ତେଣୁ, ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକ ରୋଗୀ ଟିସୁରେ ଜୈବିକ ଦୃଷ୍ଟିରୁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ଖୋଜିବା ପାଇଁ ଆମର କୋଷ ପୃଥକୀକରଣ ଏବଂ ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି ପ୍ରଯୁକ୍ତିର ବିଶ୍ୱସ୍ତତା ଏବଂ କ୍ଷମତାକୁ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରେ।
ଆମର ବିଶ୍ଳେଷଣ ରୋଗୀଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ଏବଂ ମଧ୍ୟରେ କୋଷ ପ୍ରକାରର ଏକ ଦୃଢ଼ ମେଟାବୋଲିକ୍ ପୃଥକୀକରଣ ମଧ୍ୟ ପ୍ରକାଶ କରିଛି (ଚିତ୍ର 2D ଏବଂ ଚିତ୍ର S4A)। ବିଶେଷକରି, ଅନ୍ୟ ରୋଗୀଙ୍କ ତୁଳନାରେ, ରୋଗୀ 70 ଭିନ୍ନ ମେଟାବୋଲିକ୍ ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟ ଦେଖାଇଥିଲେ (ଚିତ୍ର 2E ଏବଂ ଚିତ୍ର S4B), ଯାହା ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ରୋଗୀଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ଯଥେଷ୍ଟ ମେଟାବୋଲିକ୍ ବିଷମତା ଥାଇପାରେ। ଏହା ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଯେ ଅନ୍ୟ ରୋଗୀଙ୍କ ତୁଳନାରେ (1.2 ରୁ 2 ଲିଟର; ଟେବୁଲ S1), ରୋଗୀ 70 (80 ମିଲି) ରେ ସଂଗୃହିତ ଆସାଇଟର ମୋଟ ପରିମାଣ କମ୍ ଥିଲା। ମୁଖ୍ୟ ଉପାଦାନ ବିଶ୍ଳେଷଣ ସମୟରେ (ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, ଆଂଶିକ ରିଡାଣ୍ଡେନ୍ସି ବିଶ୍ଳେଷଣ ବ୍ୟବହାର କରି) ଆନ୍ତଃ-ରୋଗୀ ବିଷମତାର ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କୋଷ ପ୍ରକାର ମଧ୍ୟରେ ସ୍ଥିର ପରିବର୍ତ୍ତନ ଦେଖାଏ, ଏବଂ କୋଷ ପ୍ରକାର ଏବଂ/କିମ୍ବା ସୂକ୍ଷ୍ମ ପରିବେଶ ସ୍ପଷ୍ଟ ଭାବରେ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ପ୍ରୋଫାଇଲ୍ (ଚିତ୍ର 2F) ଅନୁସାରେ ସଂଗୃହିତ ହୋଇଥାଏ। ଏକକ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ସର ବିଶ୍ଳେଷଣ ଏହି ପ୍ରଭାବଗୁଡ଼ିକୁ ଗୁରୁତ୍ୱ ଦେଇଥିଲା ଏବଂ କୋଷ ପ୍ରକାର ଏବଂ ସୂକ୍ଷ୍ମ ପରିବେଶ ମଧ୍ୟରେ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପାର୍ଥକ୍ୟ ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲା। ଏହା ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଯେ ସର୍ବାଧିକ ପାର୍ଥକ୍ୟ ହେଉଛି MNA, ଯାହା ସାଧାରଣତଃ CD45- କୋଷ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମରରେ ପ୍ରବେଶ କରୁଥିବା CD4+ ଏବଂ CD8+ କୋଷରେ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥାଏ (ଚିତ୍ର 3A)। CD4 + କୋଷ ପାଇଁ, ଏହି ପ୍ରଭାବ ସବୁଠାରୁ ସ୍ପଷ୍ଟ, ଏବଂ CD8 + କୋଷରେ MNA ମଧ୍ୟ ପରିବେଶ ଦ୍ୱାରା ଦୃଢ଼ ଭାବରେ ପ୍ରଭାବିତ ହୋଇଥିବା ପରି ମନେହୁଏ। ତଥାପି, ଏହା ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ନୁହେଁ, କାରଣ ଟ୍ୟୁମର CD8+ ସ୍କୋର ପାଇଁ ଛଅ ଜଣ ରୋଗୀଙ୍କ ମଧ୍ୟରୁ କେବଳ ତିନି ଜଣଙ୍କୁ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରାଯାଇପାରିବ। MNA ବ୍ୟତୀତ, ଆସାଇଟ୍ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମରର ବିଭିନ୍ନ ପ୍ରକାରର କୋଷରେ, TIL ରେ ଖରାପ ଭାବରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ମଧ୍ୟ ଭିନ୍ନ ଭାବରେ ସମୃଦ୍ଧ (ଚିତ୍ର S3 ଏବଂ S4)। ତେଣୁ, ଏହି ତଥ୍ୟ ଅଧିକ ଗବେଷଣା ପାଇଁ ଇମ୍ୟୁନୋମୋଡୁଲେଟ୍ରି ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ସର ଏକ ପ୍ରତିଶ୍ରୁତିପୂର୍ଣ୍ଣ ସେଟ୍ ପ୍ରକାଶ କରେ।
(କ) ଜ୍ୱର ଏବଂ ଟ୍ୟୁମରରୁ CD4+, CD8+ ଏବଂ CD45- କୋଷରେ MNA ର ସାଧାରଣକୃତ ବିଷୟବସ୍ତୁ। ବାକ୍ସ ପ୍ଲଟ୍ ମଧ୍ୟମା (ରେଖା), ଇଣ୍ଟରକ୍ୱାର୍ଟାଇଲ୍ ପରିସର (ଫ୍ରେମ୍ ହିଞ୍ଜ) ଏବଂ ଡାଟା ପରିସର ଦେଖାଏ, ଇଣ୍ଟରକ୍ୱାର୍ଟାଇଲ୍ ପରିସର (ଫ୍ରେମ୍ ହ୍ୱିସ୍କର) ର 1.5 ଗୁଣ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ। ରୋଗୀ ସାମଗ୍ରୀ ଏବଂ ପଦ୍ଧତିରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ଅନୁସାରେ, P ମୂଲ୍ୟ (*P<0.05 ଏବଂ **P<0.01) ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବା ପାଇଁ ରୋଗୀଙ୍କ ଲିମା ମୂଲ୍ୟ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। (ଖ) MNA ମେଟାବୋଲିଜିମର ଯୋଜନାବଦ୍ଧ ଚିତ୍ର (60)। ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ସ: S-ଆଡେନୋସିଲ୍-1-ମେଥିଓନାଇନ୍; SAH, S-ଆଡେନୋସାଇନ୍-1-ହୋମୋସିଷ୍ଟାଇନ୍; NA, ନିକୋଟିନାମାଇଡ୍; MNA, 1-ମିଥାଇଲ୍ନିକୋଟିନାମାଇଡ୍; 2-PY, 1-ମିଥାଇଲ୍- 2-ପାଇରିଡୋନ୍-5-କାର୍ବୋକ୍ସାମାଇଡ୍; 4-PY, 1-ମିଥାଇଲ୍-4-ପାଇରିଡୋନ୍-5-କାର୍ବୋକ୍ସାମାଇଡ୍; NR, ନିକୋଟିନାମାଇଡ୍ ରାଇବୋଜ୍; NMN, ନିକୋଟିନାମାଇଡ୍ ମୋନୋନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟ୍ରାଇଡ୍। ଏନଜାଇମ (ସବୁଜ): NNMT, ନିକୋଟିନାମାଇଡ୍ N-ମିଥାଇଲଟ୍ରାନ୍ସଫେରେଜ୍; SIRT, ସିର୍ଟୁଇନ୍ସ; NAMPT, ନିକୋଟିନାମାଇଡ୍ ଫସଫୋରିବୋସିଲ୍ ଟ୍ରାନ୍ସଫେରେଜ୍; AOX1, ଆଲଡିହାଇଡ୍ ଅକ୍ସିଡେଜ୍ 1; NRK, ନିକୋଟିନାମାଇଡ୍ ରାଇବୋସାଇଡ୍ କାନେଜ୍; NMNAT, ନିକୋଟିନାମାଇଡ୍ ମୋନୋ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ ଆଡେନାଇଲେଟ୍ ଟ୍ରାନ୍ସଫେରେଜ୍; Pnp1, ପ୍ୟୁରିନ୍ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓସାଇଡ୍ ଫସଫୋରିଲେଜ୍। (C) ଆସାଇଟ୍ (ଧୂସର) ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର (ଲାଲ; n = 3 ରୋଗୀ) ର scRNA-seq ର t-SNE। (D) scRNA-seq ବ୍ୟବହାର କରି ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ବିଭିନ୍ନ କୋଷ ଜନସଂଖ୍ୟାରେ NNMT ପ୍ରକାଶନ। (E) SK-OV-3, ମାନବ ଭ୍ରୁଣୀୟ ବୃକକ୍ (HEK) 293T, T କୋଷ ଏବଂ MNA-ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିବା T କୋଷରେ NNMT ଏବଂ AOX1 ର ପ୍ରକାଶନ। SK-OV-3 ତୁଳନାରେ ଫୋଲ୍ଡ ହୋଇଥିବା ପ୍ରକାଶନ ଦେଖାଯାଇଛି। SEM ସହିତ ପ୍ରକାଶନ ଢାଞ୍ଚା ଦେଖାଯାଇଛି (n = 6 ସୁସ୍ଥ ଦାତା)। 35 ରୁ ଅଧିକ Ct ମୂଲ୍ୟଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇ ପାରିବ ନାହିଁ (UD) ବୋଲି ବିବେଚନା କରାଯାଏ। (F) SK-OV-3, HEK293T, T କୋଷ ଏବଂ 8mM MNA ସହିତ ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିବା T କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ SLC22A1 ଏବଂ SLC22A2 ର ପ୍ରକାଶନ। SK-OV-3 ତୁଳନାରେ ଫୋଲ୍ଡ ହୋଇଥିବା ପ୍ରକାଶନ ଦେଖାଯାଇଛି। SEM ସହିତ ପ୍ରକାଶନ ଢାଞ୍ଚା ଦେଖାଯାଇଛି (n = 6 ସୁସ୍ଥ ଦାତା)। 35 ରୁ ଅଧିକ Ct ମୂଲ୍ୟଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇ ପାରିବ ନାହିଁ (UD) ବୋଲି ବିବେଚନା କରାଯାଏ। (G) MNA ସହିତ 72 ଘଣ୍ଟା ଇନକ୍ୟୁବେସନ୍ ପରେ ସକ୍ରିୟ ସୁସ୍ଥ ଦାତା T କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ କୋଷ MNA ବିଷୟବସ୍ତୁ। SEM ସହିତ ପ୍ରକାଶନ ଢାଞ୍ଚା ଦେଖାଯାଇଛି (n = 4 ସୁସ୍ଥ ଦାତା)।
ନିକୋଟିନାମାଇଡ୍ N-ମିଥାଇଲଟ୍ରାନ୍ସଫେରେଜ୍ (NNMT; ଚିତ୍ର 3B) ଦ୍ୱାରା S-ଆଡେନୋସିଲ୍-1-ମେଥିଓନିନ୍ (SAM) ରୁ ​​ନିକୋଟିନାମାଇଡ୍ (NA) କୁ ମିଥାଇଲ ଗ୍ରୁପ୍ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରି MNA ଉତ୍ପାଦନ କରାଯାଏ। NNMT ବିଭିନ୍ନ ମାନବ କର୍କଟ ରୋଗରେ ଅତ୍ୟଧିକ ପ୍ରକାଶିତ ହୁଏ ଏବଂ ଏହା ପ୍ରସାର, ଆକ୍ରମଣ ଏବଂ ମେଟାଷ୍ଟାସିସ୍ ସହିତ ଜଡିତ (25-27)। TME ରେ T କୋଷରେ MNA ର ଉତ୍ସକୁ ଭଲ ଭାବରେ ବୁଝିବା ପାଇଁ, ଆମେ ତିନି ଜଣ HGSC ରୋଗୀଙ୍କ ଆସାଇଟ୍ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମରରେ କୋଷ ପ୍ରକାର ମଧ୍ୟରେ NNMT ର ପ୍ରକାଶନକୁ ଚିହ୍ନିତ କରିବା ପାଇଁ scRNA-seq ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ (ସାରଣୀ S5)। ପ୍ରାୟ 6,500 କୋଷର ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦେଖାଇଥିଲା ଯେ ଆସାଇଟ୍ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର ପରିବେଶରେ, NNMT ପ୍ରକାଶନ ଅନୁମାନିତ ଫାଇବ୍ରୋବ୍ଲାଷ୍ଟ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର କୋଷ ଜନସଂଖ୍ୟା (ଚିତ୍ର 3, C ଏବଂ D) ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ସୀମିତ ଥିଲା। ଏହା ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଯେ PTPRC (CD45 +) ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା କୌଣସି ଜନସଂଖ୍ୟାରେ କୌଣସି ସ୍ପଷ୍ଟ NNMT ପ୍ରକାଶନ ନାହିଁ (ଚିତ୍ର 3D ଏବଂ ଚିତ୍ର S5A), ଯାହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମ୍‌ରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା MNA ଟି କୋଷରେ ପ୍ରବେଶ କରାଯାଇଛି। ଆଲଡିହାଇଡ୍ ଅକ୍ସିଡେଜ୍ 1 (AOX1) ର ପ୍ରକାଶନ MNA କୁ 1-ମିଥାଇଲ୍-2-ପାଇରିଡୋନ୍-5-କାର୍ବୋକ୍ସାମାଇଡ୍ (2-PYR) କିମ୍ବା 1-ମିଥାଇଲ୍-4-ପାଇରିଡୋନ୍-5-କାର୍ବୋକ୍ସାମାଇଡ୍ (4- PYR) ରେ ପରିଣତ କରେ; ଚିତ୍ର 3B) ମଧ୍ୟ COL1A1 (ଚିତ୍ର S5A) ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା ଫାଇବ୍ରୋବ୍ଲାଷ୍ଟର ଜନସଂଖ୍ୟା ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ସୀମିତ, ଯାହା ଏକତ୍ର ସୂଚିତ କରେ ଯେ T କୋଷଗୁଡିକ ପାରମ୍ପରିକ MNA ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ କ୍ଷମତାର ଅଭାବ ରଖେ। HGSC ରୋଗୀଙ୍କ ଠାରୁ ଆସାଇଟସ୍ ରୁ ଦ୍ୱିତୀୟ ସ୍ୱାଧୀନ କୋଷ ତଥ୍ୟ ସେଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଏହି MNA-ସମ୍ବନ୍ଧିତ ଜିନ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରକାଶନ ଢାଞ୍ଚା ଯାଞ୍ଚ କରାଯାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର S5B; n = 6) (16)। ଏହା ସହିତ, MNA ସହିତ ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିବା ସୁସ୍ଥ ଦାତା T କୋଷଗୁଡ଼ିକର ପରିମାଣାତ୍ମକ ପଲିମରେଜ୍ ଚେନ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା (qPCR) ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦେଖାଇଲା ଯେ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ SK-OV-3 ଡିମ୍ବାଶୟ ଟ୍ୟୁମର କୋଷ ସହିତ ତୁଳନା କଲେ, NNMT କିମ୍ବା AOX1 ପ୍ରାୟ ପ୍ରକାଶିତ ହୋଇନଥିଲା (ଚିତ୍ର 3E)। ଏହି ଅପ୍ରତ୍ୟାଶିତ ଫଳାଫଳ ସୂଚିତ କରେ ଯେ MNA ଫାଇବ୍ରୋବ୍ଲାଷ୍ଟ କିମ୍ବା ଟ୍ୟୁମରରୁ TME ରେ ସଂଲଗ୍ନ T କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ କ୍ଷରିତ ହୋଇପାରେ।
ଯଦିଓ ପ୍ରାର୍ଥୀମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ଦ୍ରବଣୀୟ ବାହକ 22 (SLC22) ପରିବାର (SLC22A1, SLC22A2 ଏବଂ SLC22A3) ଦ୍ୱାରା ଏନକୋଡ୍ କରାଯାଇଥିବା ଜୈବିକ କ୍ୟାଟେସନ୍ ପରିବହନକାରୀ 1 ରୁ 3 (OCT1, OCT2 ଏବଂ OCT3) ପରିବାର ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ, MNA ର ସମ୍ଭାବ୍ୟ ପରିବହନକାରୀମାନେ ଏପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଅପରିଭାଷିତ (28)। ସୁସ୍ଥ ଦାତା T କୋଷରୁ mRNA ର QPCR SLC22A1 ର କମ ପ୍ରକାଶନ ସ୍ତର କିନ୍ତୁ SLC22A2 ର ଅଚିହ୍ନିତ ସ୍ତର ଦେଖାଇଲା, ଯାହା ନିଶ୍ଚିତ କରିଛି ଯେ ଏହା ପୂର୍ବରୁ ସାହିତ୍ୟରେ ରିପୋର୍ଟ କରାଯାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 3F) (29)। ବିପରୀତରେ, SK-OV-3 ଓଭାରିଆନ୍ ଟ୍ୟୁମର କୋଷ ରେଖା ଉଭୟ ପରିବହନକାରୀଙ୍କ ଉଚ୍ଚ ସ୍ତର ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲା ​​(ଚିତ୍ର 3F)।
T କୋଷଗୁଡିକର ବିଦେଶୀ MNA ଶୋଷଣ କରିବାର କ୍ଷମତା ଅଛି କି ନାହିଁ ତାହା ପରୀକ୍ଷା କରିବା ପାଇଁ, MNA ର ବିଭିନ୍ନ ସାନ୍ଦ୍ରତା ଉପସ୍ଥିତିରେ ସୁସ୍ଥ ଦାତା T କୋଷଗୁଡିକୁ 72 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ କଲଚର କରାଯାଇଥିଲା। ବାହ୍ୟ MNA ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ, MNA ର କୋଷୀୟ ବିଷୟବସ୍ତୁ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇପାରିବ ନାହିଁ (ଚିତ୍ର 3G)। ତଥାପି, ବାହ୍ୟ MNA ସହିତ ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିବା ସକ୍ରିୟ T କୋଷଗୁଡିକ କୋଷଗୁଡିକରେ MNA ବିଷୟବସ୍ତୁରେ 6 mM MNA ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଏକ ଡୋଜ୍-ନିର୍ଭରଶୀଳ ବୃଦ୍ଧି ଦେଖାଇଥିଲେ (ଚିତ୍ର 3G)। ଏହି ଫଳାଫଳ ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ ପରିବହନକାରୀ ପ୍ରକାଶନର ନିମ୍ନ ସ୍ତର ଏବଂ intracellular MNA ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ ପାଇଁ ଦାୟୀ ମୁଖ୍ୟ ଏନଜାଇମର ଅଭାବ ସତ୍ତ୍ୱେ, TIL ଏପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ MNA ଗ୍ରହଣ କରିପାରିବ।
ରୋଗୀଙ୍କ T କୋଷ ଏବଂ ଇନ୍ ଭିଟ୍ରୋ MNA ଅବଶୋଷଣ ପରୀକ୍ଷଣରେ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ସର ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମ୍ କର୍କଟ-ସମ୍ପର୍କିତ ଫାଇବ୍ରୋବ୍ଲାଷ୍ଟ (CAF) MNA କ୍ଷରଣ କରିବାର ସମ୍ଭାବନାକୁ ବୃଦ୍ଧି କରେ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର କୋଷଗୁଡ଼ିକ TIL ର ଫେନୋଟାଇପ୍ ଏବଂ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରିପାରେ। T କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଉପରେ MNA ର ପ୍ରଭାବ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବା ପାଇଁ, MNA ର ଉପସ୍ଥିତି କିମ୍ବା ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ ସୁସ୍ଥ ଦାତା T କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ଇନ୍ ଭିଟ୍ରୋରେ ସକ୍ରିୟ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର ପ୍ରସାର ଏବଂ ସାଇଟୋକାଇନ୍ ଉତ୍ପାଦନ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରାଯାଇଥିଲା। ସର୍ବାଧିକ ଡୋଜରେ MNA ଯୋଡିବାର 7 ଦିନ ପରେ, ଜନସଂଖ୍ୟା ଦ୍ୱିଗୁଣନ ସଂଖ୍ୟା ମଧ୍ୟମ ଭାବରେ ହ୍ରାସ ପାଇଥିଲା, ଯେତେବେଳେ ସମସ୍ତ ଡୋଜରେ ଶକ୍ତି ବଜାୟ ରହିଥିଲା ​​(ଚିତ୍ର 4A)। ଏହା ସହିତ, ବାହ୍ୟ MNA ର ଚିକିତ୍ସା ଫଳରେ ଟ୍ୟୁମର ନେକ୍ରୋସିସ୍ ଫ୍ୟାକ୍ଟର-α ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା CD4 + ଏବଂ CD8 + T କୋଷଗୁଡ଼ିକର ଅନୁପାତରେ ବୃଦ୍ଧି ଘଟିଥିଲା ​​(TNFα; ଚିତ୍ର 4B)। ବିପରୀତରେ, CD4 + T କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ IFN-γ ର କୋଷକୋଷୀୟ ଉତ୍ପାଦନ ଯଥେଷ୍ଟ ହ୍ରାସ ପାଇଥିଲା, କିନ୍ତୁ CD8 + T କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ନୁହେଁ, ଏବଂ ଇଣ୍ଟରଲ୍ୟୁକିନ୍ 2 ରେ କୌଣସି ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପରିବର୍ତ୍ତନ ହୋଇନଥିଲା (IL-2; ଚିତ୍ର 4, C ଏବଂ D)। ତେଣୁ, ଏହି MNA-ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିବା T କୋଷ ସଂସ୍କୃତିରୁ ସୁପରନାଟାଣ୍ଟମାନଙ୍କର ଏନଜାଇମ-ଲିଙ୍କ୍ଡ ଇମ୍ୟୁନୋସର୍ବଣ୍ଟ ପରୀକ୍ଷା (ELISA) TNFα ରେ ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ବୃଦ୍ଧି, IFN-γ ରେ ହ୍ରାସ ଏବଂ IL-2 ରେ କୌଣସି ପରିବର୍ତ୍ତନ ଦେଖାଇଲା ନାହିଁ (ଚିତ୍ର 4, E ରୁ G)। IFN-γ ର ହ୍ରାସ ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ MNA T କୋଷଗୁଡ଼ିକର ଆଣ୍ଟି-ଟ୍ୟୁମର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ବାଧା ଦେବାରେ ଏକ ଭୂମିକା ଗ୍ରହଣ କରିପାରେ। T କୋଷ-ମଧ୍ୟସ୍ଥ ସାଇଟୋଟକ୍ସିସିଟି ଉପରେ MNA ର ପ୍ରଭାବକୁ ଅନୁକରଣ କରିବା ପାଇଁ, ସବୁଜ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ ପ୍ରୋଟିନ୍ (GFP) -CAR-T) କୋଷ ଦ୍ୱାରା ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ଫୋଲେଟ୍ ରିସେପ୍ଟର α ଏବଂ CAR-T (GFP) କୁ ଟାର୍ଗେଟ କରୁଥିବା କାଇମେରିକ୍ ଆଣ୍ଟିଜେନ୍ ରିସେପ୍ଟର T (FRα-CAR-T) କୋଷଗୁଡ଼ିକ ସୁସ୍ଥ ଦାତା ପେରିଫେରାଲ୍ ରକ୍ତ ମୋନୋନ୍ୟୁକ୍ଲିୟର କୋଷ (PBMC) ଦ୍ୱାରା ଉତ୍ପାଦିତ ହୁଏ। MNA ର ଉପସ୍ଥିତିରେ CAR-T କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ 24 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ କଲଚର କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା’ପରେ 10:1 ର ଏକ ପ୍ରଭାବକରୁ ଟାର୍ଗେଟ ଅନୁପାତରେ ଫୋଲେଟ୍ ରିସେପ୍ଟର α ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା ମାନବ SK-OV-3 ଓଭାରିଆନ୍ ଟ୍ୟୁମର କୋଷ ସହିତ ସହ-କଲ୍ଚର କରାଯାଇଥିଲା। MNA ଚିକିତ୍ସା ଫଳରେ FRα-CAR-T କୋଷଗୁଡ଼ିକର ହତ୍ୟା କାର୍ଯ୍ୟକଳାପରେ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ହ୍ରାସ ଘଟିଥିଲା, ଯାହା ଆଡେନୋସିନ୍ ସହିତ ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିବା FRα-CAR-T କୋଷ ସହିତ ସମାନ ଥିଲା (ଚିତ୍ର 4H)।
(A) ଦିନ 7 ରେ କଲଚରରୁ ସିଧାସଳଖ ମୋଟ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ କୋଷ ଗଣନା ଏବଂ ଜନସଂଖ୍ୟା ଦ୍ୱିଗୁଣନ (PD)। ବାର୍ ଗ୍ରାଫ୍ ଛଅ ଜଣ ସୁସ୍ଥ ଦାତାଙ୍କ ହାରାହାରି + SEM ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ। ଅତି କମରେ n = 3 ସ୍ୱାଧୀନ ପରୀକ୍ଷଣରୁ ତଥ୍ୟ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ। (B ରୁ D) CD3/CD28 ଏବଂ IL-2 କୁ 7 ଦିନ ପାଇଁ ସେମାନଙ୍କର ସମ୍ପୃକ୍ତ MNA ସାନ୍ଦ୍ରତାରେ T କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ସକ୍ରିୟ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। ବିଶ୍ଳେଷଣ ପୂର୍ବରୁ, କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ PMA/ionomycin ସହିତ GolgiStop ସହିତ 4 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଉତ୍ତେଜିତ କରାଯାଇଥିଲା। T କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ TNFα (B) ପ୍ରକାଶନ। ଉଦାହରଣ ଚିତ୍ର (ବାମ) ଏବଂ ଜୀବନ୍ତ କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ TNFα ପ୍ରକାଶନର ସାରଣୀ ତଥ୍ୟ (ଡାହାଣ)। T କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ IFN-γ (C) ଏବଂ IL-2 (D) ପ୍ରକାଶନ। ସାଇଟୋକାଇନ୍ସର ପ୍ରକାଶନ ପ୍ରବାହ ସାଇଟୋମେଟ୍ରି ଦ୍ୱାରା ମାପ କରାଯାଇଥିଲା। ବାର୍ ଗ୍ରାଫ୍ ହାରାହାରି (n = 6 ସୁସ୍ଥ ଦାତା) + SEM ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ। P ମୂଲ୍ୟ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବା ପାଇଁ ଭିନ୍ନତାର ଏକ-ପାଖ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଏବଂ ପୁନରାବୃତ୍ତି ମାପ (*P<0.05 ଏବଂ **P<0.01) ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ଅତି କମରେ n = 3 ସ୍ୱାଧୀନ ପରୀକ୍ଷଣରୁ ତଥ୍ୟ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ। (E ରୁ G) CD3/CD28 ଏବଂ IL-2 କୁ 7 ଦିନ ପାଇଁ ସେମାନଙ୍କର ସମ୍ପୃକ୍ତ MNA ସାନ୍ଦ୍ରତାରେ T କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ସକ୍ରିୟ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। PMA/ionomycin ଉତ୍ତେଜନାର 4 ଘଣ୍ଟା ପୂର୍ବରୁ ଏବଂ ପରେ ମଧ୍ୟମ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା। TNFα (E), IFN-γ (F) ଏବଂ IL-2 (G) ର ସାନ୍ଦ୍ରତା ELISA ଦ୍ୱାରା ମାପ କରାଯାଇଥିଲା। ବାର୍ ଗ୍ରାଫ୍ ମଧ୍ୟମ (n = 5 ସୁସ୍ଥ ଦାତା) + SEM କୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ। ଭିନ୍ନତା ଏବଂ ପୁନରାବୃତ୍ତି ମାପ (*P<0.05) ର ଏକ-ପାଖ ବିଶ୍ଳେଷଣ ବ୍ୟବହାର କରି P ମୂଲ୍ୟ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଏ। ବିନ୍ଦୁଯୁକ୍ତ ରେଖା ଚିହ୍ନଟର ଚିହ୍ନଟ ସୀମା ସୂଚାଇଥାଏ। (H) କୋଷ ଲିସିସ୍ ପରୀକ୍ଷା। FRα-CAR-T କିମ୍ବା GFP-CAR-T କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ 24 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଆଡେନୋସାଇନ୍ (250μM) କିମ୍ବା MNA (10 mM) ସହିତ ଆଡଜଷ୍ଟ କରାଯାଇଥିଲା, କିମ୍ବା ଚିକିତ୍ସା ନକରି ଛାଡି ଦିଆଯାଇଥିଲା (Ctrl)। SK-OV-3 କୋଷଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରତିଶତ ହତ୍ୟା ମାପ କରାଯାଇଥିଲା। P ମୂଲ୍ୟ Welch t ପରୀକ୍ଷା (*P<0.5 ଏବଂ **P<0.01) ଦ୍ୱାରା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା।
MNA-ନିର୍ଭରଶୀଳ TNFα ପ୍ରକାଶନ ନିୟନ୍ତ୍ରଣର ଏକ ଯାନ୍ତ୍ରିକ ବୁଝାମଣା ହାସଲ କରିବା ପାଇଁ, MNA-ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିବା T କୋଷଗୁଡ଼ିକର TNFα mRNAରେ ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡ଼ିକର ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରାଯାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 5A)। MNA ସହିତ ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିବା ସୁସ୍ଥ ଦାତା T କୋଷଗୁଡ଼ିକ TNFα ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ ସ୍ତରର ଦୁଇଗୁଣ ବୃଦ୍ଧି ଦେଖାଇଥିଲେ, ଯାହା ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ MNA TNFα ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନଲ୍ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଉପରେ ନିର୍ଭରଶୀଳ। ଏହି ସମ୍ଭାବ୍ୟ ନିୟାମକ ଯନ୍ତ୍ରପାତିର ତଦନ୍ତ କରିବା ପାଇଁ, TNFαକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରୁଥିବା ଦୁଇଟି ଜଣାଶୁଣା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ କାରକ, ଯଥା ସକ୍ରିୟ T କୋଷ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟର ଫ୍ୟାକ୍ଟର (NFAT) ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରୋଟିନ୍ 1 (Sp1), ପ୍ରକ୍ସିମାଲ TNFα ପ୍ରମୋଟର (30) ସହିତ MNA ବାଇଣ୍ଡିଂର ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରାଯାଇଥିଲା। TNFα ପ୍ରମୋଟରରେ 6ଟି ଚିହ୍ନଟ NFAT ବାଇଣ୍ଡିଂ ସାଇଟ୍ ଏବଂ 2ଟି Sp1 ବାଇଣ୍ଡିଂ ସାଇଟ୍ ଅଛି, ଗୋଟିଏ ସ୍ଥାନରେ ଓଭରଲାପ୍ ହେଉଛି [-55 ବେସ୍ ପେୟାର (bp) 5'cap ରୁ] (30)। କ୍ରୋମାଟିନ୍ ଇମ୍ୟୁନୋପ୍ରେସିପିଟେସନ୍ (ChIP) ଦେଖାଇଲା ଯେ MNA ସହିତ ଚିକିତ୍ସା କଲେ, TNFα ପ୍ରମୋଟର ସହିତ Sp1 ର ବାଇଣ୍ଡିଂ ତିନିଗୁଣ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଲା। NFAT ର ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତି ମଧ୍ୟ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଲା ଏବଂ ଗୁରୁତ୍ୱ ପାଖକୁ ଗଲା (ଚିତ୍ର 5B)। ଏହି ତଥ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ MNA Sp1 ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ ମାଧ୍ୟମରେ TNFα ର ପ୍ରକାଶନକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରେ, ଏବଂ କିଛି ପରିମାଣରେ NFAT ର ପ୍ରକାଶନକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରେ।
(A) MNA ବିନା ସଂସ୍କୃତ T କୋଷ ସହିତ ତୁଳନା କଲେ, MNA ସହିତ ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିବା T କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ TNFα ପ୍ରକାଶନର ଫୋଲ୍ଡ ପରିବର୍ତ୍ତନ ଦେଖାଯାଇଛି। SEM ସହିତ ପ୍ରକାଶନ ଢାଞ୍ଚା ଦେଖାଯାଇଛି (n = 5 ସୁସ୍ଥ ଦାତା)। ଅତି କମରେ n = 3 ସ୍ୱାଧୀନ ପରୀକ୍ଷଣରୁ ତଥ୍ୟ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ। (B) NFAT ଏବଂ Sp1 ପରେ 8 mM MNA ସହିତ କିମ୍ବା ବିନା ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିବା T କୋଷଗୁଡ଼ିକର TNFα ପ୍ରମୋଟରଙ୍କୁ (Ctrl) ଏବଂ PMA/ionomycin ଉତ୍ତେଜନା ସହିତ 4 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ମିଶ୍ରଣ କରାଯାଇଥିଲା। ଇମ୍ୟୁନୋଗ୍ଲୋବୁଲିନ୍ G (IgG) ଏବଂ H3 କୁ ଇମ୍ୟୁନୋପ୍ରେସିପିଟେସନ୍ ପାଇଁ ଯଥାକ୍ରମେ ନକାରାତ୍ମକ ଏବଂ ଯୁକ୍ତାତ୍ମକ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। ChIP ର ପରିମାଣୀକରଣ ଦର୍ଶାଇଛି ଯେ MNA-ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିବା କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ TNFα ପ୍ରମୋଟର ସହିତ Sp1 ଏବଂ NFAT ର ବନ୍ଧନ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ତୁଳନାରେ ଅନେକ ଗୁଣ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଛି। ଅତି କମରେ n = 3 ସ୍ୱାଧୀନ ପରୀକ୍ଷଣରୁ ତଥ୍ୟ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ। ଏକାଧିକ t-ପରୀକ୍ଷଣ ଦ୍ୱାରା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିବା P ମୂଲ୍ୟ (*** P <0.01)। (C) HGSC ର ଆସାଇଟ ସହିତ ତୁଳନା କଲେ, T କୋଷଗୁଡ଼ିକ (ନନ୍-ସାଇଟୋଟକ୍ସିକ) ଟ୍ୟୁମରରେ TNF ର ବର୍ଦ୍ଧିତ ପ୍ରକାଶନ ଦେଖାଇଥିଲେ। ରଙ୍ଗଗୁଡ଼ିକ ବିଭିନ୍ନ ରୋଗୀଙ୍କୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରନ୍ତି। ପ୍ରଦର୍ଶିତ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ଅନିୟମିତ ଭାବରେ 300 ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ନମୁନା କରାଯାଇଛି ଏବଂ ଓଭରଡ୍ରିଂକୁ ସୀମିତ କରିବା ପାଇଁ ଝିଟିପିଟି କରାଯାଇଛି (** Padj = 0.0076)। (D) ଡିମ୍ବାଶୟ କର୍କଟ ପାଇଁ MNA ର ପ୍ରସ୍ତାବିତ ମଡେଲ। MNA TME ରେ ଟ୍ୟୁମର କୋଷ ଏବଂ ଫାଇବ୍ରୋବ୍ଲାଷ୍ଟରେ ଉତ୍ପାଦିତ ହୁଏ ଏବଂ T କୋଷ ଦ୍ୱାରା ଗ୍ରହଣ କରାଯାଏ। MNA TNFα ପ୍ରମୋଟରଙ୍କ ସହିତ Sp1 ର ବନ୍ଧନ ବୃଦ୍ଧି କରେ, ଯାହା ଫଳରେ TNFα ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ ଏବଂ TNFα ସାଇଟୋକାଇନ୍ ଉତ୍ପାଦନ ବୃଦ୍ଧି ହୁଏ। MNA IFN-γ ରେ ମଧ୍ୟ ହ୍ରାସ ଘଟେ। T କୋଷ କାର୍ଯ୍ୟର ନିରୋଧ ହତ୍ୟା କ୍ଷମତା ହ୍ରାସ କରେ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର ବୃଦ୍ଧିକୁ ତ୍ୱରାନ୍ୱିତ କରେ।
ରିପୋର୍ଟ ଅନୁଯାୟୀ, TNFα ର ଆଗ ଏବଂ ପଛ ଉପରେ ନିର୍ଭରଶୀଳ ଆଣ୍ଟି-ଟ୍ୟୁମର ଏବଂ ଆଣ୍ଟି-ଟ୍ୟୁମର ପ୍ରଭାବ ଅଛି, କିନ୍ତୁ ଡିମ୍ବାଶୟ କର୍କଟ ରୋଗର ବୃଦ୍ଧି ଏବଂ ମେଟାଷ୍ଟାସିସ୍ କୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରିବାରେ ଏହାର ଏକ ଜଣାଶୁଣା ଭୂମିକା ଅଛି (31-33)। ରିପୋର୍ଟ ଅନୁଯାୟୀ, ଡିମ୍ବାଶୟ କର୍କଟ ରୋଗୀଙ୍କ ଆସାଇଟ୍ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର ଟିସୁରେ TNFα ର ସାନ୍ଦ୍ରତା ସୌମ୍ୟ ଟିସୁ (34-36) ତୁଳନାରେ ଅଧିକ। ଯନ୍ତ୍ରପାତି ଦୃଷ୍ଟିରୁ, TNFα ଧଳା ରକ୍ତ କୋଷର ସକ୍ରିୟକରଣ, କାର୍ଯ୍ୟ ଏବଂ ପ୍ରସାରକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରିପାରିବ ଏବଂ କର୍କଟ କୋଷର ଫେନୋଟାଇପ୍ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରିପାରିବ (37, 38)। ଏହି ଫଳାଫଳ ସହିତ ସମନ୍ୱୟ ରଖି, ଡିଫରେନ୍ସିଆଲ୍ ଜିନ୍ ପ୍ରକାଶନ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦେଖାଇଲା ଯେ ଆସାଇଟ୍ ତୁଳନାରେ ଟ୍ୟୁମର ଟିସୁରେ T କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ TNF ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 5C)। TNF ପ୍ରକାଶନରେ ବୃଦ୍ଧି କେବଳ ଅଣ-ସାଇଟୋଟକ୍ସିକ ଫେନୋଟାଇପ୍ (ଚିତ୍ର S5A) ସହିତ T କୋଷ ଜନସଂଖ୍ୟାରେ ସ୍ପଷ୍ଟ ଥିଲା। ସଂକ୍ଷେପରେ, ଏହି ତଥ୍ୟ ଏହି ଦୃଷ୍ଟିକୋଣକୁ ସମର୍ଥନ କରେ ଯେ HGSC ରେ MNA ର ଦ୍ୱୈତ ଇମ୍ୟୁନୋସପ୍ରେସିଭ୍ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ ପ୍ରଭାବ ଅଛି।
ପ୍ରବାହ ସାଇଟୋମେଟ୍ରି ଉପରେ ଆଧାରିତ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ ଲେବଲିଂ TIL ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ ଅଧ୍ୟୟନ ପାଇଁ ମୁଖ୍ୟ ପଦ୍ଧତି ପାଲଟିଛି। ଏହି ଅଧ୍ୟୟନଗୁଡ଼ିକ ଦର୍ଶାଇଛନ୍ତି ଯେ ଦ୍ୱିତୀୟ ଲିମ୍ଫଏଡ୍ ଅଙ୍ଗରୁ ପେରିଫେରାଲ୍ ରକ୍ତ ଲିମ୍ଫୋସାଇଟ୍ କିମ୍ବା T କୋଷ ସହିତ ତୁଳନା କଲେ, ମୁରିନ୍ ଏବଂ ମାନବ TIL ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଗ୍ରହଣ କରିବାର ଅଧିକ ପ୍ରବୃତ୍ତି (4, 39) ଏବଂ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ କାର୍ଯ୍ୟର ଧୀରେ ଧୀରେ କ୍ଷତି (19, 40) ଥାଏ। ଯଦିଓ ଆମେ ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ ସମାନ ଫଳାଫଳ ଦେଖିଛୁ, ପ୍ରମୁଖ ବିକାଶ ହେଉଛି ସମାନ ରିସେକ୍ଟ ହୋଇଥିବା ଟ୍ୟୁମର ଟିସୁରୁ ଟ୍ୟୁମର କୋଷ ଏବଂ TIL ର ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ ତୁଳନା କରିବା। ଏହି ପୂର୍ବ ରିପୋର୍ଟଗୁଡ଼ିକ ମଧ୍ୟରୁ କିଛି ସହିତ ସମନ୍ୱିତ, ଆସାଇଟ୍ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମରରୁ ଟ୍ୟୁମର (CD45-EpCAM +) କୋଷଗୁଡିକ CD8 + ଏବଂ CD4 + T କୋଷ ଅପେକ୍ଷା ଅଧିକ ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଗ୍ରହଣ କରିଥାଏ, ଯାହା ସମର୍ଥନ କରେ ଯେ ଟ୍ୟୁମର କୋଷଗୁଡିକର ଉଚ୍ଚ ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଗ୍ରହଣକୁ T କୋଷ ସହିତ ତୁଳନା କରାଯାଇପାରିବ। T କୋଷ ପ୍ରତିଯୋଗିତାର ଧାରଣା। TME। ତଥାପି, ଟ୍ୟୁମର କୋଷଗୁଡିକର ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ CD8 + T କୋଷ ଅପେକ୍ଷା ଅଧିକ, କିନ୍ତୁ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ CD4 + T କୋଷ ସହିତ ସମାନ। ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକ ଉଦୀୟମାନ ଥିମକୁ ଦୃଢ଼ କରେ ଯେ ଅକ୍ସିଡେଟିଭ୍ ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ ଟ୍ୟୁମର କୋଷ ପାଇଁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ (41, 42)। ସେମାନେ ଏହା ମଧ୍ୟ ପରାମର୍ଶ ଦିଅନ୍ତି ଯେ CD8 + T କୋଷଗୁଡ଼ିକ CD4 + T କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଅପେକ୍ଷା ଅକ୍ସିଡେଟିଭ ଡିସଫଙ୍କସନ୍ ପ୍ରତି ଅଧିକ ସମ୍ବେଦନଶୀଳ ହୋଇପାରେ, କିମ୍ବା CD4 + T କୋଷଗୁଡ଼ିକ ମାଇଟୋଚୋଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ବଜାୟ ରଖିବା ପାଇଁ ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ବ୍ୟତୀତ କାର୍ବନ ଉତ୍ସ ବ୍ୟବହାର କରିପାରନ୍ତି (43, 44)। ଏହା ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଯେ ଆମେ CD4 + T ପ୍ରଭାବକ, T ପ୍ରଭାବକ ମେମୋରୀ ଏବଂ ଆସାଇଟରେ T କେନ୍ଦ୍ରୀୟ ମେମୋରୀ କୋଷଗୁଡ଼ିକ ମଧ୍ୟରେ ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଗ୍ରହଣ କିମ୍ବା ମାଇଟୋଚୋଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପରେ କୌଣସି ପାର୍ଥକ୍ୟ ଦେଖିନାହୁଁ। ସେହିପରି, ଟ୍ୟୁମରରେ CD8 + T କୋଷଗୁଡ଼ିକର ପାର୍ଥକ୍ୟ ଅବସ୍ଥା ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଗ୍ରହଣରେ ପରିବର୍ତ୍ତନ ସହିତ କୌଣସି ସମ୍ପର୍କ ରଖିନାହିଁ, ଯାହା ଭିଟ୍ରୋରେ ସଂସ୍କୃତ T କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଏବଂ ଭିଭୋରେ ମାନବ TIL ମଧ୍ୟରେ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପାର୍ଥକ୍ୟକୁ ଉଜ୍ଜ୍ୱଳ କରିଥାଏ (22)। ଏହି ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣଗୁଡ଼ିକ ନିରପେକ୍ଷ ସ୍ୱୟଂଚାଳିତ କୋଷ ଜନସଂଖ୍ୟା ଆବଣ୍ଟନ ବ୍ୟବହାର ଦ୍ୱାରା ମଧ୍ୟ ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା ଆହୁରି ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲା ​​ଯେ ଟ୍ୟୁମର କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଅପେକ୍ଷା ଅଧିକ ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଗ୍ରହଣ ଏବଂ ମାଇଟୋଚୋଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ସହିତ CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + କୋଷଗୁଡ଼ିକ ପ୍ରଚଳିତ କିନ୍ତୁ ମେଟାବୋଲିକ୍ ସକ୍ରିୟ କୋଷ ଜନସଂଖ୍ୟା ଅଛି। ଏହି ଜନସଂଖ୍ୟା scRNA-seq ବିଶ୍ଳେଷଣରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ମାଇଲଏଡ୍ ସପ୍ରେସର୍ କୋଷ କିମ୍ବା ପ୍ଲାଜମାସାଇଟଏଡ୍ ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ କୋଷଗୁଡ଼ିକର ପୁଟେଟିଭ୍ ଉପଜନସଂଖ୍ୟାକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରିପାରେ। ଯଦିଓ ଏହି ଦୁଇଟି ମାନବ ଡିମ୍ବାଶୟ ଟ୍ୟୁମରରେ ରିପୋର୍ଟ କରାଯାଇଛି [45], ତଥାପି ସେମାନଙ୍କୁ ଏହି ମାଇଲଏଡ୍ ଉପଜନସଂଖ୍ୟାକୁ ବର୍ଣ୍ଣନା କରିବା ପାଇଁ ଆହୁରି କାର୍ଯ୍ୟ କରିବାକୁ ପଡିବ।
ଯଦିଓ ପ୍ରବାହ ସାଇଟୋମେଟ୍ରି-ଆଧାରିତ ପଦ୍ଧତିଗୁଡ଼ିକ କୋଷ ପ୍ରକାର ମଧ୍ୟରେ ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଏବଂ ଅକ୍ସିଡେଟିଭ୍ ମେଟାବୋଲିଜିମ୍‌ରେ ସାଧାରଣ ପାର୍ଥକ୍ୟକୁ ସ୍ପଷ୍ଟ କରିପାରିବ, TME ରେ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ ପାଇଁ ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ କିମ୍ବା ଅନ୍ୟ କାର୍ବନ ଉତ୍ସ ଦ୍ୱାରା ଉତ୍ପାଦିତ ସଠିକ୍ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍‌ଗୁଡ଼ିକ ଏପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇ ନାହିଁ। ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ TIL ସବସେଟ୍‌କୁ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ଉପସ୍ଥିତି କିମ୍ବା ଅନୁପସ୍ଥିତି ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବା ପାଇଁ ଏକ୍ସାଇଜ୍ ହୋଇଥିବା ଟିସୁରୁ କୋଷ ଜନସଂଖ୍ୟାର ପରିଷ୍କାରକରଣ ଆବଶ୍ୟକ। ତେଣୁ, ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି ସହିତ ମିଳିତ ଆମର କୋଷ ସମୃଦ୍ଧି ପଦ୍ଧତି ମେଳ ଖାଉଥିବା ରୋଗୀ ନମୁନାରେ T କୋଷ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର କୋଷ ଜନସଂଖ୍ୟାରେ ଭିନ୍ନ ଭାବରେ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥିବା ମେଟାବୋଲାଇଟ୍‌ଗୁଡ଼ିକ ବିଷୟରେ ଅନ୍ତର୍ଦୃଷ୍ଟି ପ୍ରଦାନ କରିପାରିବ। ଯଦିଓ ଏହି ପଦ୍ଧତିର ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ-ସକ୍ରିୟ କୋଷ ସଜାଡ଼ିବା ଉପରେ ସୁବିଧା ଅଛି, କିନ୍ତୁ ଅନ୍ତର୍ନିହିତ ସ୍ଥିରତା ଏବଂ/କିମ୍ବା ଦ୍ରୁତ ପରିବର୍ତ୍ତନ ହାର (22) ଯୋଗୁଁ କିଛି ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ଲାଇବ୍ରେରୀ ପ୍ରଭାବିତ ହୋଇପାରେ। ତଥାପି, ଆମର ପଦ୍ଧତି ଦୁଇଟି ସ୍ୱୀକୃତିପ୍ରାପ୍ତ ଇମ୍ୟୁନୋସପ୍ରେସିଭ୍ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରିବାରେ ସକ୍ଷମ ହୋଇଥିଲା, ଆଡେନୋସାଇନ୍ ଏବଂ କାଇନୁରେନିନ୍, କାରଣ ସେମାନେ ନମୁନା ପ୍ରକାର ମଧ୍ୟରେ ବହୁତ ଭିନ୍ନ।
ଟ୍ୟୁମର ଏବଂ TIL ଉପପ୍ରକାରର ଆମର ମେଟାବୋନୋମିକ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଡିମ୍ବାଶୟ TME ରେ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ସର ଭୂମିକା ବିଷୟରେ ଅଧିକ ଅନ୍ତର୍ଦୃଷ୍ଟି ପ୍ରଦାନ କରେ। ପ୍ରଥମେ, ପ୍ରବାହ ସାଇଟୋମେଟ୍ରି ବ୍ୟବହାର କରି, ଆମେ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କଲୁ ଯେ ଟ୍ୟୁମର ଏବଂ CD4 + T କୋଷ ମଧ୍ୟରେ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପରେ କୌଣସି ପାର୍ଥକ୍ୟ ନାହିଁ। ତଥାପି, LC-MS/MS ବିଶ୍ଳେଷଣ ଏହି ଜନସଂଖ୍ୟା ମଧ୍ୟରେ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ସର ପ୍ରଚୁରତାରେ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପରିବର୍ତ୍ତନ ପ୍ରକାଶ କରିଛି, ଯାହା ସୂଚାଇଛି ଯେ TIL ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ ଏବଂ ଏହାର ସାମଗ୍ରିକ ମେଟାବୋଲିକ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ବିଷୟରେ ନିଷ୍କର୍ଷ ପାଇଁ ଯତ୍ନର ସହିତ ବ୍ୟାଖ୍ୟା ଆବଶ୍ୟକ। ଦ୍ୱିତୀୟତଃ, MNA ହେଉଛି ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ଯାହା ଜଲୋରରେ CD45-କୋଷ ଏବଂ T କୋଷ ମଧ୍ୟରେ ସର୍ବାଧିକ ପାର୍ଥକ୍ୟ ସହିତ, ଟ୍ୟୁମର ନୁହେଁ। ତେଣୁ, କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟାଲାଇଜେସନ୍ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର ସ୍ଥାନ TIL ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ ଉପରେ ଭିନ୍ନ ପ୍ରଭାବ ପକାଇପାରେ, ଯାହା ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ସୂକ୍ଷ୍ମ ପରିବେଶରେ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ବିଷମତାକୁ ହାଇଲାଇଟ୍ କରେ। ତୃତୀୟତଃ, MNA-ଉତ୍ପାଦନକାରୀ ଏନଜାଇମ୍ NNMT ର ପ୍ରକାଶନ ମୁଖ୍ୟତଃ CAF ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ସୀମିତ, ଯାହା କମ୍ ପରିମାଣରେ ଟ୍ୟୁମର କୋଷ ଅଟେ, କିନ୍ତୁ ଟ୍ୟୁମର-ଉତ୍ପନ୍ନ T କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ଚିହ୍ନଟଯୋଗ୍ୟ MNA ସ୍ତର ପରିଲକ୍ଷିତ ହୁଏ। ଡିମ୍ବାଶୟ CAF ରେ NNMT ର ଅତ୍ୟଧିକ ପ୍ରକାଶନର ଏକ ଜଣାଶୁଣା କର୍କଟ-ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ ପ୍ରଭାବ ଅଛି, ଆଂଶିକ ଭାବରେ CAF ମେଟାବୋଲିଜିମ୍, ଟ୍ୟୁମର ଆକ୍ରମଣ ଏବଂ ମେଟାଷ୍ଟାସିସ୍ (27) ର ପ୍ରୋତ୍ସାହନ ଯୋଗୁଁ। ଯଦିଓ TIL ର ସାମଗ୍ରିକ ସ୍ତର ମଧ୍ୟମ, CAF ରେ NNMT ର ପ୍ରକାଶନ କର୍କଟ ଜିନୋମ୍ ଆଟଲାସ୍ (TCGA) ମେସେନକାଇମାଲ ଉପପ୍ରକାର ସହିତ ଘନିଷ୍ଠ ଭାବରେ ଜଡିତ, ଯାହା ଖରାପ ପୂର୍ବାନୁମାନ ସହିତ ଜଡିତ (27, 46, 47)। ଶେଷରେ, MNA ଅବନତି ପାଇଁ ଦାୟୀ ଏଞ୍ଜାଇମ୍ AOX1 ର ପ୍ରକାଶନ ମଧ୍ୟ CAF ଜନସଂଖ୍ୟା ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ସୀମିତ, ଯାହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ T କୋଷଗୁଡିକ MNA ମେଟାବୋଲିଜ୍ କରିବାର କ୍ଷମତାର ଅଭାବ ରଖେ। ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକ ଏହି ଧାରଣାକୁ ସମର୍ଥନ କରେ ଯେ ଯଦିଓ ଏହି ସନ୍ଧାନକୁ ଯାଞ୍ଚ କରିବା ପାଇଁ ଆହୁରି କାର୍ଯ୍ୟ ଆବଶ୍ୟକ, T କୋଷଗୁଡିକରେ MNA ର ଉଚ୍ଚ ସ୍ତର ଏକ ଇମ୍ୟୁନୋସପ୍ରେସିଭ୍ CAF ମାଇକ୍ରୋଏନଭାଇରନ୍ମେଣ୍ଟର ଉପସ୍ଥିତିକୁ ସୂଚାଇପାରେ।
MNA ପରିବହନକାରୀଙ୍କ କମ୍ ପ୍ରକାଶନ ସ୍ତର ଏବଂ MNA ମେଟାବୋଲିଜିମ୍‌ରେ ଜଡିତ ପ୍ରମୁଖ ପ୍ରୋଟିନ୍‌ର ଅଚିହ୍ନିତ ସ୍ତରକୁ ଦୃଷ୍ଟିରେ ରଖି, T କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ MNAର ଉପସ୍ଥିତି ଅପ୍ରତ୍ୟାଶିତ। NNMT କିମ୍ବା AOX1 ଦୁଇଟି ସ୍ୱାଧୀନ କୋହର୍ଟର scRNA-seq ବିଶ୍ଳେଷଣ ଏବଂ ଲକ୍ଷ୍ୟ କରାଯାଇଥିବା qPCR ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇପାରିଲା ନାହିଁ। ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକ ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ MNA T କୋଷ ଦ୍ୱାରା ସଂଶ୍ଳେଷିତ ନୁହେଁ, ବରଂ ଆଖପାଖ TME ରୁ ଶୋଷିତ ହୁଏ। ଇନ୍ ଭିଟ୍ରୋ ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡ଼ିକ ଦର୍ଶାଏ ଯେ T କୋଷଗୁଡ଼ିକ ବାହ୍ୟ MNA ସଂଗ୍ରହ କରିବାକୁ ପ୍ରବୃତ୍ତ।
ଆମର ଇନ ଭିଟ୍ରୋ ଅଧ୍ୟୟନରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ବାହ୍ୟ MNA ଟି କୋଷରେ TNFα ର ପ୍ରକାଶନକୁ ପ୍ରେରଣା ଦିଏ ଏବଂ TNFα ପ୍ରମୋଟର ସହିତ Sp1 ର ବନ୍ଧନକୁ ବୃଦ୍ଧି କରେ। ଯଦିଓ TNFα ର ଟ୍ୟୁମର-ପ୍ରତିରୋଧୀ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର-ପ୍ରତିରୋଧୀ କାର୍ଯ୍ୟ ଉଭୟ ଅଛି, ଡିମ୍ବାଶୟ କର୍କଟ ରୋଗରେ, TNFα ଡିମ୍ବାଶୟ କର୍କଟ ରୋଗର ବୃଦ୍ଧିକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରିପାରେ (31-33)। ଡିମ୍ବାଶୟ ଟ୍ୟୁମର କୋଷ ସଂସ୍କୃତିରେ TNFα ର ନିଷ୍କ୍ରିୟକରଣ କିମ୍ବା ମାଉସ ମଡେଲରେ TNFα ସିଗନାଲର ଦୂରୀକରଣ TNFα-ମଧ୍ୟସ୍ଥ ପ୍ରଦାହକାରୀ ସାଇଟୋକାଇନ୍ ଉତ୍ପାଦନକୁ ଉନ୍ନତ କରିପାରିବ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର ବୃଦ୍ଧିକୁ ବାଧା ଦେଇପାରେ (32, 35)। ତେଣୁ, ଏହି କ୍ଷେତ୍ରରେ, TME-ପ୍ରାପ୍ତ MNA ଅଟୋକ୍ରାଇନ୍ ଲୁପ୍ ମାଧ୍ୟମରେ TNFα-ନିର୍ଭରଶୀଳ ମେକାନିଜିମ୍ ମାଧ୍ୟମରେ ଏକ ପ୍ରୋ-ଇନ୍ଫ୍ଲେମେଟାରୀ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ଭାବରେ କାର୍ଯ୍ୟ କରିପାରିବ, ଯାହା ଦ୍ଵାରା ଡିମ୍ବାଶୟ କର୍କଟ ରୋଗର ଘଟଣା ଏବଂ ପ୍ରସାରକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରେ (31)। ଏହି ସମ୍ଭାବନା ଉପରେ ଆଧାର କରି, TNFα ଅବରୋଧକୁ ଡିମ୍ବାଶୟ କର୍କଟ ରୋଗ ପାଇଁ ଏକ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଚିକିତ୍ସା ଏଜେଣ୍ଟ ଭାବରେ ଅଧ୍ୟୟନ କରାଯାଉଛି (37, 48, 49)। ଏହା ସହିତ, MNA ଡିମ୍ବାଶୟ ଟ୍ୟୁମର କୋଷଗୁଡ଼ିକ ପ୍ରତି CAR-T କୋଷର ସାଇଟୋଟକ୍ସିସିଟିକୁ ପ୍ରଭାବିତ କରେ, MNA-ମଧ୍ୟସ୍ଥ ପ୍ରତିରୋଧକ ଦମନ ପାଇଁ ଅଧିକ ପ୍ରମାଣ ପ୍ରଦାନ କରେ। ସାମୂହିକ ଭାବରେ, ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡ଼ିକ ଏକ ମଡେଲକୁ ସୂଚାଇଥାଏ ଯେଉଁଥିରେ ଟ୍ୟୁମର ଏବଂ CAF କୋଷଗୁଡ଼ିକ MNA କୁ ବାହ୍ୟକୋଷୀୟ TME ରେ କ୍ଷରଣ କରନ୍ତି। (i) TNF-ପ୍ରେରିତ ଡିମ୍ବାଶୟ କର୍କଟ ବୃଦ୍ଧି ଉତ୍ତେଜନା ଏବଂ (ii) MNA-ପ୍ରେରିତ T କୋଷ ସାଇଟୋଟକ୍ସିକ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ନିରୋଧ ମାଧ୍ୟମରେ, ଏହାର ଦ୍ୱୈତ ଟ୍ୟୁମର ପ୍ରଭାବ ହୋଇପାରେ (ଚିତ୍ର 5D)।
ଶେଷରେ, ଦ୍ରୁତ କୋଷ ସମୃଦ୍ଧି, ଏକକ-କୋଷ କ୍ରମ ଏବଂ ମେଟାବୋଲିକ୍ ପ୍ରୋଫାଇଲିଂର ମିଶ୍ରଣ ପ୍ରୟୋଗ କରି, ଏହି ଅଧ୍ୟୟନ HGSC ରୋଗୀଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ଟ୍ୟୁମର ଏବଂ ଆସାଇଟ୍ କୋଷ ମଧ୍ୟରେ ବିଶାଳ ଇମ୍ୟୁନୋମେଟାବୋଲୋମିକ୍ ପାର୍ଥକ୍ୟ ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲା। ଏହି ବ୍ୟାପକ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦର୍ଶାଇଥିଲା ଯେ T କୋଷ ମଧ୍ୟରେ ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଗ୍ରହଣ ଏବଂ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପରେ ପାର୍ଥକ୍ୟ ଅଛି, ଏବଂ MNA କୁ ଏକ ଅଣ-କୋଷ ସ୍ୱୟଂଚାଳିତ ପ୍ରତିରକ୍ଷା ନିୟାମକ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ଭାବରେ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଛି। ଏହି ତଥ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ମାନବ କର୍କଟ ରୋଗରେ TME କିପରି T କୋଷ ମେଟାବୋଲିଜିମ୍ କୁ ପ୍ରଭାବିତ କରେ ତାହା ଉପରେ ପ୍ରଭାବ ପକାଇଥାଏ। ଯଦିଓ T କୋଷ ଏବଂ କର୍କଟ କୋଷ ମଧ୍ୟରେ ପୁଷ୍ଟିସାର ପାଇଁ ପ୍ରତ୍ୟକ୍ଷ ପ୍ରତିଯୋଗିତା ରିପୋର୍ଟ କରାଯାଇଛି, ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ମଧ୍ୟ ଟ୍ୟୁମର ଅଗ୍ରଗତିକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରିବା ଏବଂ ସମ୍ଭବତଃ ଅନ୍ତର୍ଜାତ ପ୍ରତିରକ୍ଷା ପ୍ରତିକ୍ରିୟାକୁ ଦମନ କରିବା ପାଇଁ ପରୋକ୍ଷ ନିୟାମକ ଭାବରେ କାର୍ଯ୍ୟ କରିପାରିବ। ଏହି ନିୟାମକ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ସର କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଭୂମିକାର ଅଧିକ ବର୍ଣ୍ଣନା ଟ୍ୟୁମର-ପ୍ରତିରକ୍ଷା ପ୍ରତିରକ୍ଷା ବୃଦ୍ଧି ପାଇଁ ବିକଳ୍ପ ରଣନୀତି ଖୋଲିପାରେ।
ରୋଗୀଙ୍କ ନମୁନା ଏବଂ କ୍ଲିନିକାଲ୍ ତଥ୍ୟ କାନାଡିଆନ୍ ଟିସୁ ରିପୋଜିଟୋରୀ ନେଟୱାର୍କ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରମାଣିତ BC କର୍କଟ ଟ୍ୟୁମର ଟିସୁ ରିପୋଜିଟୋରୀ ମାଧ୍ୟମରେ ପ୍ରାପ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା। BC କର୍କଟ ଗବେଷଣା ନୀତି କମିଟି ଏବଂ ବ୍ରିଟିଶ୍ କଲମ୍ବିଆ ବିଶ୍ୱବିଦ୍ୟାଳୟ (H07-00463) ଦ୍ୱାରା ଅନୁମୋଦିତ ପ୍ରୋଟୋକଲ୍ ଅନୁଯାୟୀ, ସମସ୍ତ ରୋଗୀଙ୍କ ନମୁନା ଏବଂ କ୍ଲିନିକାଲ୍ ତଥ୍ୟ ସୂଚିତ ଲିଖିତ ସମ୍ମତି ପ୍ରାପ୍ତ କରିଥିଲା ​​କିମ୍ବା ଆନୁଷ୍ଠାନିକ ଭାବରେ ସେମାନଙ୍କର ସମ୍ମତି ପରିତ୍ୟାଗ କରିଥିଲା। ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ ପ୍ରମାଣିତ ବାୟୋବ୍ୟାଙ୍କ (BRC-00290) ରେ ସଂରକ୍ଷଣ କରାଯାଇଛି। ରୋଗୀଙ୍କ ବିସ୍ତୃତ ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ଟେବୁଲ S1 ଏବଂ S5 ରେ ଦର୍ଶାଯାଇଛି। କ୍ରାଇଓପ୍ରିଜର୍ଭେସନ୍ ପାଇଁ, ରୋଗୀଙ୍କ ଟ୍ୟୁମର ନମୁନାକୁ ଯାନ୍ତ୍ରିକ ଭାବରେ ବିଘଟନ କରିବା ପାଇଁ ଏକ ସ୍କାଲ୍ପେଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ ଏବଂ ତା’ପରେ ଏକ କୋଷ ସସପେନସନ୍ ପାଇବା ପାଇଁ ଏହାକୁ 100-ମାଇକ୍ରୋନ୍ ଫିଲ୍ଟର ମାଧ୍ୟମରେ ଠେଲି ଦିଆଯାଏ। ରୋଗୀଙ୍କ ଆସାଇଟ୍ସକୁ 4°C ରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 1500 rpm ରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା ଦ୍ୱାରା କୋଷଗୁଡିକ ପେଲେଟ୍ ହୋଇଯାଏ ଏବଂ ସୁପରନାଟାଣ୍ଟ ବାହାର କରାଯାଏ। ଟ୍ୟୁମର ଏବଂ ଆସାଇଟରୁ ପ୍ରାପ୍ତ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ 50% ତାପ-ନିଷ୍କ୍ରିୟ ମାନବ AB ସେରମ୍ (ସିଗ୍ମା-ଆଲଡ୍ରିଚ୍), 40% RPMI-1640 (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ଏବଂ 10% ଡାଇମିଥାଇଲ୍ ସଲଫକ୍ସାଇଡ୍ ରେ କ୍ରାୟୋପ୍ରିଜର୍ଭ କରାଯାଇଥିଲା। ଏହି ସଂରକ୍ଷିତ ଏକକ କୋଷ ସସପେନସନଗୁଡ଼ିକୁ ତରଳାଇ ତଳେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ମେଟାବୋଲିମିକ୍ସ ଏବଂ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ନିର୍ଣ୍ଣୟ ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା।
ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ମାଧ୍ୟମ 0.22 μm ଫିଲ୍ଟର ହୋଇଥିବା 50:50 ପରିପୂରକ RPMI 1640: AimV ନେଇ ଗଠିତ। RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) 10% ତାପ-ନିଷ୍କ୍ରିୟ ମାନବ AB ସେରମ୍ (ସିଗ୍ମା-ଆଲଡ୍ରିଚ୍), 12.5 mM ହେପ୍ସ (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍), 2 mM l-glutamine (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍), 1 x ପେନିସିଲିନ୍ ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟୋମାଇସିନ୍ (ପେନଷ୍ଟ୍ରେପ୍) ଦ୍ରବଣ (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ଏବଂ 50 μMB-ମର୍କାପ୍ଟୋଏଥାନଲ୍ ସହିତ ପରିପୂରକ। AimV (ଇନଭିଟ୍ରୋଜେନ୍) 20 mM ହେପ୍ସ (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ଏବଂ 2 mM l-glutamine (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ସହିତ ପରିପୂରକ। ପ୍ରବାହ ସାଇଟୋମିଟର ଷ୍ଟେନିଂ ବଫରରେ 0.22 μm ଫିଲ୍ଟର ହୋଇଥିବା ଫସଫେଟ୍ ବଫର୍ ସାଲାଇନ୍ (PBS; ଇନଭିଟ୍ରୋଜେନ୍) 3% ତାପ-ନିଷ୍କ୍ରିୟ AB ମାନବ ସେରମ୍ (ସିଗ୍ମା) ସହିତ ପରିପୂରକ ଥିଲା। କୋଷ ସମୃଦ୍ଧି ବଫର 0.22μm ଫିଲ୍ଟର ହୋଇଥିବା PBS ରେ ଗଠିତ ଏବଂ 0.5% ତାପ-ନିଷ୍କ୍ରିୟ ମାନବ AB ସେରମ୍ (ସିଗ୍ମା-ଆଲଡ୍ରିଚ୍) ସହିତ ପରିପୂରକ।
୩୭°C ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ମାଧ୍ୟମରେ, କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ୧୦ nM MT DR ଏବଂ ୧୦୦ μM 2-NBDG ସହିତ ୩୦ ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ରଙ୍ଗ କରାଯାଇଥିଲା। ଏହା ପରେ, କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ୧୫ ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ୪°C ରେ ଭାବାବିଲିଟି ଡାଇ eF506 ସହିତ ରଙ୍ଗ କରାଯାଇଥିଲା। FC ବ୍ଲକ (eBioscience) ଏବଂ ବ୍ରିଲିଆଣ୍ଟ ଷ୍ଟେନ୍ ବଫର (BD ବାୟୋସାଇନ୍ସ) ରେ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ପୁନଃସ୍ଥାପିତ କରନ୍ତୁ, ପ୍ରବାହ ସାଇଟୋମିଟର ଷ୍ଟେନ୍ ବଫରରେ (ନିର୍ମାତାଙ୍କ ନିର୍ଦ୍ଦେଶ ଅନୁଯାୟୀ) ତରଳ କରନ୍ତୁ, ଏବଂ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ୧୦ ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ। ୪°C ରେ ଫ୍ଲୋ ସାଇଟୋମେଟ୍ରି ଷ୍ଟେନ୍ ବଫରରେ ୨୦ ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଆଣ୍ଟିବଡି (ଟେବୁଲ S2) ର ଏକ ସେଟ୍ ସହିତ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ରଙ୍ଗ କରନ୍ତୁ। ବିଶ୍ଳେଷଣ ପୂର୍ବରୁ ଫ୍ଲୋ ସାଇଟୋମେଟ୍ରି ଷ୍ଟେନ୍ ବଫର (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R ବିନ୍ୟାସ) ରେ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ପୁନଃସ୍ଥାପିତ କରନ୍ତୁ। କୋଷ ଗଣନା ତଥ୍ୟ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବା ପାଇଁ SpectroFlo ଏବଂ FlowJo V10 ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ, ଏବଂ ତଥ୍ୟ ସୃଷ୍ଟି କରିବା ପାଇଁ GraphPad Prism 8 ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। 2-NBDG ଏବଂ MT DR ର ମଧ୍ୟମା ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ତୀବ୍ରତା (MFI) ଲଗ୍-ସାଧାରଣ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା’ପରେ ମେଳ ଖାଉଥିବା ରୋଗୀଙ୍କ ହିସାବ ପାଇଁ ପରିସଂଖ୍ୟାନ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ଏକ ଯୋଡା ଟି ପରୀକ୍ଷା ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। ବିଶ୍ଳେଷଣରୁ 40 ରୁ କମ୍ ଇଭେଣ୍ଟ ଥିବା ସମସ୍ତ ଜନସଂଖ୍ୟାକୁ ବାହାର କରନ୍ତୁ; ପରିସଂଖ୍ୟାନ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଏବଂ ତଥ୍ୟ ଭିଜୁଆଲାଇଜେସନ୍ କରିବା ପୂର୍ବରୁ ଯେକୌଣସି ନକାରାତ୍ମକ ମୂଲ୍ୟ ପାଇଁ 1 ର MFI ମୂଲ୍ୟ ପ୍ରବେଶ କରନ୍ତୁ।
ଉପରୋକ୍ତ ପ୍ରକ୍ରିୟା ପ୍ୟାନେଲର ମାନୁଆଲ୍ ଗେଟିଂ ରଣନୀତିକୁ ପରିପୂରକ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ FlowJo ରେ ମୃତ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ଦୂର କରିବା ପରେ ଜନସଂଖ୍ୟାକୁ ସ୍ୱୟଂଚାଳିତ ଭାବରେ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ନ୍ୟସ୍ତ କରିବା ପାଇଁ ଆକୃତି ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ବୃକ୍ଷ (FAUST) (21) ଦ୍ୱାରା ପୂର୍ଣ୍ଣ ଆନୋଟେସନ୍ ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ। ଭୁଲ ଭାବରେ ବଣ୍ଟନ ହୋଇଥିବା ପରି ମନେ ହେଉଥିବା ଜନସଂଖ୍ୟା (PD1+ କୁ PD1-ଟ୍ୟୁମର କୋଷ ସହିତ ମିଶ୍ରଣ କରି) ଏବଂ ସଂରକ୍ଷିତ ଜନସଂଖ୍ୟାକୁ ମିଶ୍ରଣ କରିବା ପାଇଁ ଆମେ ମାନୁଆଲ୍ ଭାବରେ ଆଉଟପୁଟ୍ ପରିଚାଳନା କରୁ। ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନାରେ ମୋଟ 11 ଜନସଂଖ୍ୟା ପାଇଁ ହାରାହାରି 2% ରୁ ଅଧିକ କୋଷ ଥାଏ।
ପିବିଏମସିକୁ ଲ୍ୟୁକୋସାଇଟ୍ ପୃଥକୀକରଣ ଉତ୍ପାଦ (STEMCELL ଟେକ୍ନୋଲୋଜି) ରୁ ପୃଥକ କରିବା ପାଇଁ ଫିକୋଲ୍ ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ ଡେନସିଟି ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗେସନ୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। CD8 ମାଇକ୍ରୋବିଡ୍ସ (ମିଲ୍ଟେନି) ବ୍ୟବହାର କରି CD8 + T କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ PBMC ରୁ ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ନିର୍ମାତାଙ୍କ ନିର୍ଦ୍ଦେଶ ଅନୁଯାୟୀ ଟ୍ରାନ୍ସଆକ୍ଟ (ମିଲ୍ଟେନି) ବ୍ୟବହାର କରି ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ମାଧ୍ୟମରେ 2 ସପ୍ତାହ ପାଇଁ ବିସ୍ତାର କରାଯାଇଥିଲା। କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) ଧାରଣ କରିଥିବା ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ମାଧ୍ୟମରେ 5 ଦିନ ପାଇଁ ଠିଆ ହେବାକୁ ଦିଆଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତାପରେ ଟ୍ରାନ୍ସଆକ୍ଟ ସହିତ ପୁନଃଉତ୍ସାହିତ କରାଯାଇଥିଲା। 7ମ ଦିନରେ, ନିର୍ମାତାଙ୍କ ନିର୍ଦ୍ଦେଶ ଅନୁଯାୟୀ, ମାନବ CD45 ମାଇକ୍ରୋବିଡ୍ସ (ମିଲ୍ଟେନି) କ୍ରମାଗତ ତିନୋଟି ରାଉଣ୍ଡରେ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ସମୃଦ୍ଧ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରବାହ ସାଇଟୋମେଟ୍ରି ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ଅଲିକୋଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା (ଉପରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ଭାବରେ), ଏବଂ LC-MS/MS ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ଦଶ ଲକ୍ଷ କୋଷକୁ ତିନିଥର ଅଲିକୋଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ନିମ୍ନରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ଅନୁସାରେ LC-MS/MS ଦ୍ୱାରା ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ କରାଯାଇଥିଲା। ଆମେ 1,000 ଆୟନ ସଂଖ୍ୟା ସହିତ ଅନୁପସ୍ଥିତ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ମୂଲ୍ୟ ଆକଳନ କରିଥିଲୁ। ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନାକୁ ମୋଟ ଆୟନ ସଂଖ୍ୟା (TIC) ଦ୍ୱାରା ସାଧାରଣୀକରଣ କରାଯାଏ, ଲଗାରିଥମିକାଲି ରୂପାନ୍ତରିତ କରାଯାଏ ଏବଂ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପୂର୍ବରୁ MetaboAnalystR ରେ ସ୍ୱୟଂଚାଳିତ ଭାବରେ ସାଧାରଣୀକରଣ କରାଯାଏ।
ପ୍ରତ୍ୟେକ ରୋଗୀଙ୍କ ଏକକ କୋଷ ସସପେନସନକୁ ତରଳାଇ ଏକ 40 μm ଫିଲ୍ଟର ମାଧ୍ୟମରେ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ମାଧ୍ୟମରେ ଫିଲ୍ଟର କରାଯାଇଥିଲା (ଉପରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ)। ନିର୍ମାତାଙ୍କ ପ୍ରୋଟୋକଲ ଅନୁଯାୟୀ, CD8+, CD4+ ଏବଂ CD45- କୋଷ ପାଇଁ (ବରଫ ଉପରେ) ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ ସମୃଦ୍ଧ କରିବା ପାଇଁ ମାଇକ୍ରୋବିଡ୍ସ (ମିଲଟେନି) ବ୍ୟବହାର କରି ଚୁମ୍ବକୀୟ ମଣି ପୃଥକୀକରଣ ଦ୍ୱାରା କ୍ରମାଗତ ତିନି ଥର ସକାରାତ୍ମକ ଚୟନ କରାଯାଇଥିଲା। ସଂକ୍ଷେପରେ, କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ କୋଷ ସମୃଦ୍ଧି ବଫରରେ (ଉପରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ) ପୁନଃସ୍ଥାପିତ କରାଯାଏ ଏବଂ ଗଣନା କରାଯାଏ। କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ 4°C ରେ 15 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ମାନବ CD8 ମଣି, ମାନବ CD4 ମଣି କିମ୍ବା ମାନବ CD45 ମଣି (ମିଲଟେନି) ସହିତ ଇନକ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା'ପରେ କୋଷ ସମୃଦ୍ଧି ବଫର ସହିତ ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା। ନମୁନାକୁ LS ସ୍ତମ୍ଭ (ମିଲଟେନି) ଦେଇ ପଠାଯାଏ, ଏବଂ ଧନାତ୍ମକ ଏବଂ ନକାରାତ୍ମକ ଭଗ୍ନାଂଶ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଏ। ଅବଧି ହ୍ରାସ କରିବା ଏବଂ କୋଷ ପୁନରୁଦ୍ଧାର ପଦକ୍ଷେପକୁ ସର୍ବାଧିକ କରିବା ପାଇଁ, CD8-ଭଗ୍ନାଂଶକୁ CD4+ ସମୃଦ୍ଧିର ଦ୍ୱିତୀୟ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ, ଏବଂ CD4-ଭଗ୍ନାଂଶକୁ ପରବର୍ତ୍ତୀ CD45-ସମ୍ୃଦ୍ଧି ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ। ପୃଥକୀକରଣ ପ୍ରକ୍ରିୟା ସମୟରେ ଦ୍ରବଣକୁ ବରଫ ଉପରେ ରଖନ୍ତୁ।
ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ନମୁନା ପ୍ରସ୍ତୁତ କରିବା ପାଇଁ, କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ଥରେ ବରଫ-ଥଣ୍ଡା ଲୁଣ ଦ୍ରବଣ ସହିତ ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନାରେ 1 ମିଲି 80% ମିଥାନଲ୍ ଯୋଡା ଯାଇଥିଲା, ତାପରେ ଘୂର୍ଣ୍ଣିକରଣ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ତରଳ ନାଇଟ୍ରୋଜେନରେ ସ୍ନାପ୍ ଫ୍ରିଜ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ ତିନୋଟି ଫ୍ରିଜ୍-ଥୋ ଚକ୍ରରେ ରଖାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 4°C ରେ 15 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 14,000 rpm ରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା ସୁପରନାଟାଣ୍ଟ ଶୁଖିବା ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ବାଷ୍ପୀଭୂତ ହୋଇଯାଏ। ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ଗୁଡ଼ିକୁ 0.03% ଫର୍ମିକ ଏସିଡର 50 μl ରେ ପୁନଃ ଦ୍ରବୀଭୂତ କରାଯାଇଥିଲା, ମିଶ୍ରଣ ପାଇଁ ଘୂର୍ଣ୍ଣିକରଣ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତାପରେ ଅବଶେଷ ଅପସାରଣ ପାଇଁ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା।
ଉପରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ସ ବାହାର କରନ୍ତୁ। ମେଟାବୋଲିମିକ୍ସ ଗବେଷଣା ପାଇଁ ସୁପରନାଟାଣ୍ଟକୁ ଏକ ଉଚ୍ଚ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ତରଳ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫି ବୋତଲରେ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରନ୍ତୁ। ବ୍ୟାଚ୍ ପ୍ରଭାବକୁ ରୋକିବା ପାଇଁ ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନାକୁ ସମାନ ସଂଖ୍ୟକ କୋଷ ସହିତ ଚିକିତ୍ସା କରିବା ପାଇଁ ଏକ ଅନିୟମିତ ଚିକିତ୍ସା ପ୍ରୋଟୋକଲ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ଆମେ ପୂର୍ବରୁ AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) ରେ ପ୍ରକାଶିତ ବିଶ୍ୱବ୍ୟାପୀ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ସର ଏକ ଗୁଣାତ୍ମକ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରିଥିଲୁ। ମଲ୍ଟିକ୍ୱାଣ୍ଟ ସଂସ୍କରଣ 2.1 ସଫ୍ଟୱେର୍ (ଆପ୍ଲାଏଡ୍ ବାୟୋସିଷ୍ଟମ୍ସ SCIEX) ବ୍ୟବହାର କରି କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫିକ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଏବଂ ଶିଖର କ୍ଷେତ୍ର ସମନ୍ୱୟ କରାଯାଇଥିଲା।
ଅନୁପସ୍ଥିତ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ମୂଲ୍ୟ ଆକଳନ କରିବା ପାଇଁ 1000 ର ଏକ ଆୟନ୍ ଗଣନା ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନାର TIC ନମୁନା ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣରୁ ଯନ୍ତ୍ରଗତ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରଚଳିତ ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡ଼ିକୁ ସଂଶୋଧନ କରିବା ପାଇଁ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ମେଟାବୋଲାଇଟ୍‌ର ସାଧାରଣକୃତ ଶିଖର କ୍ଷେତ୍ର ଗଣନା କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। TIC ସାଧାରଣୀକରଣ ହେବା ପରେ, MetaboAnalystR(51) (ଡିଫଲ୍ଟ ପାରାମିଟର) ଲଗାରିଦମିକ୍ ରୂପାନ୍ତର ଏବଂ ସ୍ୱୟଂଚାଳିତ ନର୍ମ ଲାଇନ୍ ସ୍କେଲିଂ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ। ଆମେ ନମୁନା ପ୍ରକାର ମଧ୍ୟରେ ମେଟାବୋଲୋମ୍ ପାର୍ଥକ୍ୟଗୁଡ଼ିକର ଅନୁସନ୍ଧାନାତ୍ମକ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବା ପାଇଁ vegan R ପ୍ୟାକେଜ୍ ସହିତ PCA ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ, ଏବଂ ରୋଗୀମାନଙ୍କର ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବା ପାଇଁ ଆଂଶିକ ରିଡାଣ୍ଡେନ୍ସି ବିଶ୍ଳେଷଣ ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ। ନମୁନା ମଧ୍ୟରେ ୟୁକ୍ଲିଡିଆନ୍ ଦୂରତାକୁ କ୍ଲଷ୍ଟର କରିବା ପାଇଁ ଏକ ହିଟ୍ ମ୍ୟାପ୍ ଡେଣ୍ଡ୍ରୋଗ୍ରାମ୍ ନିର୍ମାଣ କରିବାକୁ ୱାର୍ଡ ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ। ଆମେ ସମଗ୍ର କୋଷ ପ୍ରକାର ଏବଂ ସୂକ୍ଷ୍ମ ପରିବେଶରେ ପାର୍ଥକ୍ୟ ଭାବରେ ପ୍ରଚୁର ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ ମାନକକୃତ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ପ୍ରଚୁରତା ଉପରେ ଲିମ୍ମା (52) ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ। ବ୍ୟାଖ୍ୟାକୁ ସରଳ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ମଡେଲକୁ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କରିବା ପାଇଁ ଗୋଷ୍ଠୀ ଅର୍ଥ ପାରାମିଟର ବ୍ୟବହାର କରୁ, ଏବଂ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଗୋଷ୍ଠୀ (n = 6 ଗୋଷ୍ଠୀ) ଭାବରେ ସୂକ୍ଷ୍ମ ପରିବେଶରେ କୋଷ ପ୍ରକାରଗୁଡ଼ିକୁ ବିଚାର କରୁ; ଗୁରୁତ୍ୱ ପରୀକ୍ଷା ପାଇଁ, ଆମେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ ପାଇଁ ତିନୋଟି ପୁନରାବୃତ୍ତି ମାପ କରିଥିଲୁ। ମିଥ୍ୟା ପ୍ରତିକୃତିକୁ ଏଡାଇବା ପାଇଁ, ରୋଗୀଙ୍କୁ ଲିମା ଡିଜାଇନରେ ଏକ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ଭାବରେ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା। ବିଭିନ୍ନ ରୋଗୀଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ସର ପାର୍ଥକ୍ୟ ଯାଞ୍ଚ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ରୋଗୀମାନଙ୍କୁ ଏକ ସ୍ଥିର ଉପାୟରେ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରି ଲିମା ମଡେଲକୁ ସଜାଡ଼ିଥିଲୁ। ଆମେ କୋଷ ପ୍ରକାର ଏବଂ ପାଡଜ୍ <0.05 (ବେଞ୍ଜାମିନି-ହୋଚବର୍ଗ ସଂଶୋଧନ) ର ସୂକ୍ଷ୍ମ ପରିବେଶ ମଧ୍ୟରେ ପୂର୍ବ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବିପରୀତତାର ଗୁରୁତ୍ୱ ରିପୋର୍ଟ କରୁ।
ମିଲଟେନି ଡେଡ୍ କୋଲ୍ ରିମୁଭାଲ୍ କିଟ୍ (>80% କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମତା) ବ୍ୟବହାର କରି ଶକ୍ତି ବୃଦ୍ଧି କରିବା ପରେ, 10x 5′ଜିନ୍ ପ୍ରକାଶନ ପ୍ରୋଟୋକଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ମୋଟ ଜୀବନ୍ତ ଫ୍ରୋଜେନ୍ ଆସାଇଟ୍ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର ନମୁନାରେ ଏକକ-କୋଷ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ଟୋମ୍ ସିକୋଇନ୍ସିଂ କରାଯାଇଥିଲା। ମେଳ ଖାଉଥିବା ଟ୍ୟୁମର ଏବଂ ଆସାଇଟ୍ ସହିତ ପାଞ୍ଚଟି ମାମଲା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା, ଯଦିଓ ଗୋଟିଏ ଟ୍ୟୁମର ନମୁନାରୁ କମ୍ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମତା ଏହାର ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତିକୁ ବାଧା ଦେଇଥିଲା। ରୋଗୀଙ୍କ ଏକାଧିକ ଚୟନ ହାସଲ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ 10x କ୍ରୋମିୟମ୍ ନିୟନ୍ତ୍ରକର ଲେନ୍‌ରେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ରୋଗୀଙ୍କ ନମୁନାକୁ ମିଶ୍ରଣ କରିଥିଲୁ, ଏବଂ ଆସାଇଟ୍ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର ସ୍ଥାନଗୁଡ଼ିକୁ ପୃଥକ ଭାବରେ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିଥିଲୁ। ସିକୋଇନ୍ସିଂ ପରେ [ଇଲୁମିନା ହାଇସେକ୍ 4000 28×98 bp ପେୟାର୍ଡ ଏଣ୍ଡ (PE), କ୍ୟୁବେକ୍ ଜିନୋମ୍; ପ୍ରତି କୋଷରେ ଟ୍ୟୁମର ଏବଂ ଆସାଇଟ ପାଇଁ ହାରାହାରି 73,488 ଏବଂ 41,378 ପାଠ୍ୟକ୍ରମ]], ଆମେ CellSNP ଏବଂ Vireo (53) ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ (CellSNP ଉପରେ ଆଧାରିତ କାରଣ GRCh38 ଦ୍ୱାରା ପ୍ରଦାନ କରାଯାଇଥିବା ସାଧାରଣ ମାନବ SNP (VCF) ଏକ ଦାତା ପରିଚୟ ପ୍ରଦାନ କରାଯାଇଛି। ଆମେ ରୋଗୀଙ୍କ ଜିନୋଟାଇପ୍ ସ୍ଥିତି (IBS) ର ନିକଟତମ ପରିଚୟ (IBS) ଅନୁମାନ କରିବା ପାଇଁ SNPRelate ବ୍ୟବହାର କରୁ, ଅଣନିର୍ଦ୍ଧାରିତ କୋଷ ଏବଂ ଡୁପ୍ଲେକ୍ସ ଭାବରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ବାଦ ଦେଇ ଏବଂ ଆସାଇଟ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର ନମୁନା ମଧ୍ୟରେ ମେଳ ଖାଉଥିବା ଦାତାମାନଙ୍କୁ (54)। ଏହି କାର୍ଯ୍ୟ ଆଧାରରେ, ଆମେ ଡାଉନଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ଟ୍ୟୁମର ଏବଂ ଆସାଇଟରେ ପ୍ରଚୁର କୋଷ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ ସହିତ ତିନୋଟି କେସ୍ ରଖିଥିଲୁ। ସ୍କେଟର (55) ଏବଂ ସ୍କ୍ରାନ (56) ବାୟୋକଣ୍ଡକ୍ଟର ପ୍ୟାକେଜିଂରେ ଏକ ଗଣ ଫିଲ୍ଟ୍ରେସନ ପଦକ୍ଷେପ କରିବା ପରେ, ଏହା ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ 6975 କୋଷ (ଟ୍ୟୁମର ଏବଂ ଆସାଇଟରୁ ଯଥାକ୍ରମେ 2792 ଏବଂ 4183 କୋଷ) ପ୍ରଦାନ କରିଥିଲା। ଆମେ ସେୟାରଡ୍ ନିକଟତମ ପଡ଼ୋଶୀ ନେଟୱାର୍କ (SNN) ର igraph's (57) Louvain କ୍ଲଷ୍ଟରିଂ ବ୍ୟବହାର କରୁ। ପ୍ରକାଶନ ଅନୁସାରେ କ୍ଲଷ୍ଟର କୋଷଗୁଡ଼ିକ ପାଇଁ ଜ୍ୟାକାର୍ଡ ଦୂରତା। ମାର୍କର ଜିନ୍ ପ୍ରକାଶନ ଉପରେ ଆଧାରିତ ପୁଟେଟିଭ୍ କୋଷ ପ୍ରକାରରେ କ୍ଲଷ୍ଟରଗୁଡ଼ିକୁ ମାନୁଆଲୀ ଆନୋଟେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ t-SNE ସହିତ ଭିଜୁଆଲାଇଜ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ସାଇଟୋଟକ୍ସିକ୍ T କୋଷଗୁଡ଼ିକ CD8A ଏବଂ GZMA ର ପ୍ରକାଶନ ଦ୍ୱାରା ପରିଭାଷିତ ହୋଇଥାଏ, କମ ରାଇବୋସୋମାଲ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରକାଶନ ସହିତ ସବକ୍ଲଷ୍ଟରଗୁଡ଼ିକୁ ବାଦ ଦେଇ। ଆମେ Izar et al. (16) ର ପ୍ରକାଶିତ ତଥ୍ୟକୁ ପ୍ରବେଶ କରିଥିଲୁ, ସେମାନଙ୍କର t-SNE ଏମ୍ବେଡିଂ ସମେତ, ପ୍ରତିରକ୍ଷା କୋଷ ମାର୍କର ଏବଂ NNMT ପ୍ରକାଶନ ମଧ୍ୟରେ ପ୍ରକାଶନ ଓଭରଲାପ୍ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରିପାରିବ।
ଫିକୋଲ୍ ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ ଡେନସିଟି ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ପିବିଏମସିକୁ ଲ୍ୟୁକୋସାଇଟ୍ ପୃଥକୀକରଣ ଉତ୍ପାଦ (STEMCELL ଟେକ୍ନୋଲୋଜି) ଠାରୁ ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା। CD3 ବିଡ୍ (ମିଲଟେନି) ବ୍ୟବହାର କରି CD3 + କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ PBMC ରୁ ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା। MNA ର ଉପସ୍ଥିତି କିମ୍ବା ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ, ପ୍ଲେଟ୍-ବାଉଣ୍ଡ CD3 (5μg/ml), ଦ୍ରବଣୀୟ CD28 (3μg/ml) ଏବଂ IL-2 (300 U/ml; ପ୍ରୋଲ୍ୟୁକିନ୍) ସହିତ CD3+ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ସକ୍ରିୟ କରାଯାଇଥିଲା। ବିସ୍ତାରର ଶେଷ ଦିନରେ, ପ୍ରବାହ ସାଇଟୋମେଟ୍ରି ଦ୍ୱାରା କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମତା (ଫିକ୍ସେବଲ୍ ଭାୟାବିଲିଟି ଡାଏ eFluor450, eBioscience) ଏବଂ ପ୍ରସାର (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରାଯାଇଥିଲା। PMA (20 ng/ml) ଏବଂ ionomycin (1μg/ml) ସହିତ 4 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ GolgiStop ସହିତ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ଉତ୍ତେଜିତ କରି ଇଫେକ୍ଟର କାର୍ଯ୍ୟର ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରନ୍ତୁ, ଏବଂ CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) ଏବଂ TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD) ନିରୀକ୍ଷଣ କରନ୍ତୁ। 4 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ PMA (20 ng/ml) ଏବଂ ionomycin (1μg/ml) ସହିତ qPCR ଏବଂ ChIP କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ଉତ୍ତେଜିତ କରନ୍ତୁ। ELISA ସୁପରନାଟାଣ୍ଟକୁ PMA (20 ng/ml) ଏବଂ ionomycin (1 μg/ml) ସହିତ 4 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଉତ୍ତେଜନା ପୂର୍ବରୁ ଏବଂ ପରେ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା।
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ବ୍ୟବହାର କରି RNA ପୃଥକ କରିବା ପାଇଁ ନିର୍ମାତାଙ୍କ ପ୍ରୋଟୋକଲ ଅନୁସରଣ କରନ୍ତୁ। ନମୁନାକୁ ଏକତ୍ର କରିବା ପାଇଁ QIAshredder (QIAGEN) ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ପରିପୂରକ DNA (cDNA) ସଂଶ୍ଳେଷଣ କରିବା ପାଇଁ cDNA କିଟ୍ (Thermo Fisher Scientific) ପାଇଁ ଉଚ୍ଚ-କ୍ଷମତା RNA ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ନିମ୍ନଲିଖିତ ପ୍ରୋବଗୁଡ଼ିକ ସହିତ (ନିର୍ମାତାଙ୍କ ପ୍ରୋଟୋକଲ ଅନୁସାରେ) ଜିନ୍ ପ୍ରକାଶନ ପରିମାଣ କରିବା ପାଇଁ TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [ଗ୍ଲିସେରାଲଡିହାଇଡ୍-3-ଫସଫେଟ୍ ଅଫ୍ ହାଇଡ୍ରୋଜେନ୍ (GAPDH)] ଏବଂ Hs01010726_m1 (SLC22A2)। ମାଇକ୍ରୋଆମ୍ପ ଅପ୍ଟିକାଲ୍ ଫିଲ୍ମ ସହିତ ମାଇକ୍ରୋଆମ୍ପ ଫାଷ୍ଟ ଅପ୍ଟିକାଲ୍ 96-ୱେଲ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ଲେଟ୍ (ଆପ୍ଲାଏଡ୍ ବାୟୋସିଷ୍ଟମ୍) ରେ ନମୁନାଗୁଡ଼ିକ StepOnePlus ରିଅଲ୍-ଟାଇମ୍ PCR ସିଷ୍ଟମ୍ (ଆପ୍ଲାଏଡ୍ ବାୟୋସିଷ୍ଟମ୍) (ଆପ୍ଲାଏଡ୍ ବାୟୋସିଷ୍ଟମ୍) ରେ ଚାଲିଥିଲା। ଯେକୌଣସି Ct ମୂଲ୍ୟ ଯାହା 35 ରୁ ଅଧିକ ହୁଏ ତାହାକୁ ଚିହ୍ନଟ ସୀମା ଉପରେ ବିବେଚନା କରାଯାଏ ଏବଂ ଏହାକୁ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇ ନପାରେ ବୋଲି ଚିହ୍ନିତ କରାଯାଏ।
ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ (58) ପରି ChIP କରନ୍ତୁ। ସଂକ୍ଷେପରେ, କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ଫର୍ମାଲ୍ଡାଇଡ୍ (ଚୂଡ଼ାନ୍ତ ସାନ୍ଦ୍ରତା 1.42%) ସହିତ ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା। 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ବରଫ ଉପରେ ପରିପୂରକ ଫୁଲିବା ବଫର (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl ଏବଂ 0.1% NP-40) ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ, ତାପରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ (58) ପରି ଇମ୍ୟୁନୋପ୍ରେସିପିଟେସନ୍ ବଫରରେ ପୁନଃସ୍ଥାପିତ କରନ୍ତୁ। ତା'ପରେ ନମୁନାକୁ ନିମ୍ନଲିଖିତ ଚକ୍ର ସହିତ ସୋନିକେଟ କରାଯାଇଥିଲା: 10 ଚକ୍ର (20 1-ସେକେଣ୍ଡ ପଲ୍ସ) ଏବଂ 40 ସେକେଣ୍ଡର ସ୍ଥିର ସମୟ। 4°CC ରେ ନମୁନା ସହିତ ChIP-ଗ୍ରେଡ୍ ଇମ୍ୟୁନୋଗ୍ଲୋବୁଲିନ୍ G (କୋଷ ସିଗନାଲିଂ ପ୍ରଯୁକ୍ତିବିଦ୍ୟା; 1μl), ହିଷ୍ଟୋନ୍ H3 (କୋଷ ସିଗନାଲିଂ ପ୍ରଯୁକ୍ତିବିଦ୍ୟା; 3μl), NFAT (ଇନଭିଟ୍ରୋଜେନ୍; 3μl) ଏବଂ SP1 (କୋଷ ସିଗନାଲିଂ ପ୍ରଯୁକ୍ତିବିଦ୍ୟା; 3μl) ଆଣ୍ଟିବଡିଗୁଡ଼ିକୁ ରାତାରାତି ଶେକ୍ କରନ୍ତୁ। ପ୍ରୋଟିନ୍ A ବିଡ୍ସ (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) କୁ 4°C ତାପମାତ୍ରାରେ ନମୁନା ସହିତ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ମୃଦୁ ହଲାଇ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ, ତା'ପରେ DNA କୁ ସମୃଦ୍ଧ କରିବା ପାଇଁ ଚେଲେକ୍ସ ବିଡ୍ସ (ବାୟୋ-ରାଡ୍) ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ, ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ହଜମ ପାଇଁ ପ୍ରୋଟିନେଜ୍ K (ଥର୍ମୋ ଫିସର) ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। PCR ଦ୍ୱାରା TNFα ପ୍ରମୋଟର ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା: ଆଗୁଆ, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; ବିପରୀତରେ, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp ଉତ୍ପାଦ)। ପ୍ରତିଛବିଗୁଡ଼ିକ ଇମେଜ୍ ଲ୍ୟାବ୍ (ବାୟୋ-ରାଡ୍) ଦ୍ୱାରା ଉତ୍ପାଦିତ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ଇମେଜ୍J ସଫ୍ଟୱେର୍ ବ୍ୟବହାର କରି ପରିମାଣ କରାଯାଇଥିଲା।
ଉପରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ଅନୁସାରେ କୋଷ ସଂସ୍କୃତି ସୁପରନାଟାଣ୍ଟ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା। ନିର୍ମାତାଙ୍କ ମାନବ TNFα ELISA କିଟ୍ (Invitrogen), ମାନବ IL-2 ELISA କିଟ୍ (Invitrogen) ଏବଂ ମାନବ IFN-γ ELISA କିଟ୍ (Abcam) ପଦ୍ଧତି ଅନୁଯାୟୀ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା। ନିର୍ମାତାଙ୍କ ପ୍ରୋଟୋକଲ ଅନୁସାରେ, TNFα ଏବଂ IL-2 ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ ସୁପରନାଟାଣ୍ଟକୁ 1:100 ଏବଂ IFN-γ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ 1:3 ତରଳ କରାଯାଇଥିଲା। 450 nm ରେ ଅବଶୋଷଣ ମାପିବା ପାଇଁ EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ।
ଫିକୋଲ୍ ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ ଡେନସିଟି ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ପିବିଏମସିକୁ ଲ୍ୟୁକୋସାଇଟ୍ ପୃଥକୀକରଣ ଉତ୍ପାଦ (STEMCELL ଟେକ୍ନୋଲୋଜି) ରୁ ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା। CD3 ବିଡ୍ (ମିଲଟେନି) ବ୍ୟବହାର କରି CD3 + କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ PBMC ରୁ ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା। MNA ର ଉପସ୍ଥିତି କିମ୍ବା ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ, CD3+ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ପ୍ଲେଟ୍-ବାଉଣ୍ଡ CD3 (5μg/ml), ଦ୍ରବଣୀୟ CD28 (3μg/ml) ଏବଂ IL-2 (300 U/ml; ପ୍ରୋଲ୍ୟୁକିନ୍) ସହିତ 3 ଦିନ ପାଇଁ ସକ୍ରିୟ କରାଯାଇଥିଲା। 3 ଦିନ ପରେ, କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 0.9% ସାଲାଇନ୍ ସହିତ ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ପେଲେଟ୍ ସ୍ନାପ୍ ଫ୍ରିଜ୍ କରାଯାଇଥିଲା। 123count eBeads ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରବାହ ସାଇଟୋମେଟ୍ରି (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R ବିନ୍ୟାସ) ଦ୍ୱାରା କୋଷ ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା।
ଉପରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ମେଟାବୋଲାଇଟ୍ସ ନିଷ୍କାସନ କରନ୍ତୁ। ଶୁଖିଲା ନିଷ୍କାସନକୁ 4000 କୋଷ ସମକକ୍ଷ/μl ସାନ୍ଦ୍ରତାରେ ପୁନଃଗଠିତ କରାଯାଇଥିଲା। ବିପରୀତ-ଫେଜ୍ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫି (1290 ଇନଫିନିଟି II, ଆଜିଲେଣ୍ଟ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି, ସାଣ୍ଟା କ୍ଲାରା, CA) ଏବଂ CORTECS T3 ସ୍ତମ୍ଭ (2.1×150 mm, କଣିକା ଆକାର 1.6-μm, ଛିଦ୍ର ଆକାର 120-Å; #186008500, ୱାଟର୍ସ) ଦ୍ୱାରା ନମୁନା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରନ୍ତୁ। ପୋଲାର ମାସ୍ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟର (6470, ଆଜିଲେଣ୍ଟ), ଯେଉଁଥିରେ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋସ୍ପ୍ରେ ଆୟନାଇଜେସନ୍ ସକାରାତ୍ମକ ମୋଡ୍ ରେ କାର୍ଯ୍ୟ କରେ। ମୋବାଇଲ୍ ପର୍ଯ୍ୟାୟ A ହେଉଛି 0.1% ଫର୍ମିକ ଏସିଡ୍ (H2O ରେ), ମୋବାଇଲ୍ ପର୍ଯ୍ୟାୟ B ହେଉଛି 90% ଆସେଟୋନିଟ୍ରାଇଲ୍, 0.1% ଫର୍ମିକ ଏସିଡ୍। LC ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ ହେଉଛି 100% A ପାଇଁ 0 ରୁ 2 ମିନିଟ୍, 99% B ପାଇଁ 2 ରୁ 7.1 ମିନିଟ୍, ଏବଂ 99% B ପାଇଁ 7.1 ରୁ 8 ମିନିଟ୍। ତା'ପରେ 3 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 0.6 ମିଲି/ମିନିଟ୍ ପ୍ରବାହ ହାରରେ ମୋବାଇଲ୍ ଫେଜ୍ A ସହିତ ସ୍ତମ୍ଭକୁ ପୁନଃସନ୍ତୁଳନ କରନ୍ତୁ। । ପ୍ରବାହ ହାର ହେଉଛି 0.4 ମିଲି/ମିନିଟ୍, ଏବଂ ସ୍ତମ୍ଭ ଚାମ୍ବରକୁ 50°C ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଗରମ କରାଯାଇଛି। ପ୍ରତିଧାରଣ ସମୟ (RT) ଏବଂ ରୂପାନ୍ତରଣ (RT = 0.882 ମିନିଟ୍, ରୂପାନ୍ତରଣ 1 = 137→94.1, ରୂପାନ୍ତରଣ 2 = 137→92, ରୂପାନ୍ତରଣ 3 = 137→78) ସ୍ଥାପନ କରିବା ପାଇଁ MNA ର ଶୁଦ୍ଧ ରାସାୟନିକ ମାନକ (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ଯେତେବେଳେ ତିନୋଟି ପରିବର୍ତ୍ତନ ସଠିକ୍ ପ୍ରତିଧାରଣ ସମୟରେ ଘଟେ, ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ସୁନିଶ୍ଚିତ କରିବା ପାଇଁ ପରିମାଣୀକରଣ ପାଇଁ ପରିବର୍ତ୍ତନ 1 ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ। MNA (ଟୋରଣ୍ଟୋ ରିସର୍ଚ୍ଚ କେମିକାଲ୍ କମ୍ପାନୀ)ର ମାନକ ବକ୍ର ଷ୍ଟକ୍ ଦ୍ରବଣ (1 mg/ml) ର ଛଅଟି ସିରିଏଲ୍ ଡାଇଲ୍ୟୁସନ୍ ଦ୍ୱାରା ସୃଷ୍ଟି ହୋଇଥିଲା ଯାହା ଦ୍ଵାରା ଯଥାକ୍ରମେ 0.1, 1.0, 10 ଏବଂ 100 ng/ml ଏବଂ 1.0 ଏବଂ 10μg/ml ତରଳ ମାନକ ପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇଥିଲା। ଚିହ୍ନଟ ସୀମା ହେଉଛି 1 ng/ml, ଏବଂ ରେଖିକ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା 10 ng/ml ଏବଂ 10μg/ml ମଧ୍ୟରେ। LC/MS ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ନମୁନା ଏବଂ ମାନକର ଦୁଇ ମାଇକ୍ରୋଲିଟରର ପ୍ରତ୍ୟେକ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ, ଏବଂ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପ୍ଲାଟଫର୍ମର ସ୍ଥିରତା ସୁନିଶ୍ଚିତ କରିବା ପାଇଁ ପ୍ରତି ଆଠଟି ଇଞ୍ଜେକ୍ସନରେ ଏକ ମିଶ୍ରିତ ଗୁଣବତ୍ତା ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ନମୁନା ଚଲାଯାଏ। ସମସ୍ତ MNA-ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିବା କୋଷ ନମୁନାର MNA ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପରୀକ୍ଷାର ରେଖିକ ପରିସର ମଧ୍ୟରେ ଥିଲା। MassHunter ପରିମାଣାତ୍ମକ ବିଶ୍ଳେଷଣ ସଫ୍ଟୱେର୍ (v9.0, Agilent) ବ୍ୟବହାର କରି ଡାଟା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା।
ଦ୍ୱିତୀୟ ପିଢ଼ିର αFR-CAR ନିର୍ମାଣ ଗୀତ ଏବଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ (59) ରୁ ନିଆଯାଇଛି। ସଂକ୍ଷେପରେ, ନିର୍ମାଣରେ ନିମ୍ନଲିଖିତ ବିଷୟବସ୍ତୁ ରହିଛି: CD8a ନେତା ଅନୁକ୍ରମ, ମାନବ αFR-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଏକକ-ଶୃଙ୍ଖଳ ପରିବର୍ତ୍ତନଶୀଳ ଖଣ୍ଡ, CD8a ହିଞ୍ଜ ଏବଂ ଟ୍ରାନ୍ସମେମ୍ବ୍ରେନ କ୍ଷେତ୍ର, CD27 ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ କୋଷ ଏବଂ CD3z ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ କୋଷ। ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ CAR ଅନୁକ୍ରମକୁ GenScript ଦ୍ୱାରା ସଂଶ୍ଳେଷିତ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା’ପରେ ଟ୍ରାନ୍ସଡକ୍ସନ ଦକ୍ଷତା ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ GFP ପ୍ରକାଶନ କ୍ୟାସେଟର ଦ୍ୱିତୀୟ-ପିଢ଼ିର ଲେଣ୍ଟିଭାଇରାଲ୍ ପ୍ରକାଶନ ଭେକ୍ଟର ଅପଷ୍ଟ୍ରିମରେ କ୍ଲୋନ୍ କରାଯାଇଥିଲା।
ଲେଣ୍ଟିଭାଇରସ୍ HEK293T କୋଷ [ଆମେରିକୀୟ ପ୍ରକାର ସଂସ୍କୃତି ସଂଗ୍ରହ (ATCC)] ର ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ ଦ୍ୱାରା ଉତ୍ପାଦିତ ହୁଏ; ଡୁଲବେକୋର ପରିବର୍ତ୍ତିତ ଇଗଲ୍ ମାଧ୍ୟମରେ 10% ଭ୍ରୁଣ ବୋଭାଇନ୍ ସେରମ୍ (FBS) ଏବଂ 1% PenStrep ଧାରଣ କରି ଚାଷ କରାଯାଏ, ଏବଂ CAR-GFP ଭେକ୍ଟର ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ ଏବଂ ପ୍ୟାକେଜିଂ ପ୍ଲାଜମିଡ୍ (psPAX2 ଏବଂ pMD2.G, Addgene) ଲାଇପୋଫେକ୍ସନ୍ ଆମାଇନ୍ (ସିଗ୍ମା-ଆଲଡ୍ରିଚ୍) ବ୍ୟବହାର କରେ। ଭୁତାଣୁ ଧାରଣକାରୀ ସୁପରନାଟାଣ୍ଟକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣର 48 ଏବଂ 72 ଘଣ୍ଟା ପରେ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା, ଫିଲ୍ଟର କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଅଲ୍ଟ୍ରାସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ଘନୀଭୂତ କରାଯାଇଥିଲା। ଘନୀଭୂତ ଭାଇରାଲ୍ ସୁପରନାଟାଣ୍ଟକୁ ଟ୍ରାନ୍ସଡକ୍ସନ୍ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ -80°C ରେ ସଂରକ୍ଷଣ କରନ୍ତୁ।
ଫିକୋଲ୍ ଗ୍ରାଡିଏଣ୍ଟ ଘନତା ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ସୁସ୍ଥ ଦାତା ଲ୍ୟୁକୋସାଇଟ୍ ପୃଥକୀକରଣ ଉତ୍ପାଦ (STEMCELL ଟେକ୍ନୋଲୋଜି) ଠାରୁ PBMC ପୃଥକ କରାଯାଏ। PBMC ରୁ CD8+ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ପୃଥକ କରିବା ପାଇଁ ପଜିଟିଭ୍ ସିଲେକ୍ସନ୍ CD8 ମାଇକ୍ରୋବିଡ୍ସ (ମିଲ୍ଟେନି) ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। TransAct (ମିଲ୍ଟେନି) ସହିତ ଏବଂ TexMACS ମାଧ୍ୟମରେ T କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ଉତ୍ତେଜିତ କରନ୍ତୁ [ମିଲ୍ଟେନି; 3% ତାପ-ନିଷ୍କ୍ରିୟ ମାନବ ସେରମ୍, 1% PenStrep ଏବଂ IL-2 (300 U/ml) ସହିତ ପରିପୂରକ]। ଉତ୍ତେଜନା ପରେ ଚବିଶ ଘଣ୍ଟା ପରେ, T କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ଲେଣ୍ଟିଭାଇରସ୍ (ପ୍ରତି 106 କୋଷରେ 10 μl ଘନୀଭୂତ ଭାଇରସ୍ ସୁପରନାଟାଣ୍ଟ) ସହିତ ଟ୍ରାନ୍ସଡକ୍ସନ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ସାଇଟେକ୍ ଅରୋରା (FSC (Forward Scatter)/SSC (ସାଇଡ୍ ସ୍କାଟର୍), ସିଙ୍ଗଲେଟ୍, GFP+ ରେ ଟ୍ରାନ୍ସଡକ୍ସନ୍ ପରେ 1 ରୁ 3 ଦିନ ପରେ), ଅତି କମରେ 30% ଟ୍ରାନ୍ସଡକ୍ସନ୍ ଦକ୍ଷତା ପ୍ରଦର୍ଶନ କରିବା ପାଇଁ କୋଷଗୁଡ଼ିକର GFP ପ୍ରକାଶନ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରନ୍ତୁ।
CAR-T କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ଇମ୍ୟୁନୋକଲ୍ଟ (STEMCELL ଟେକ୍ନୋଲୋଜିସ୍; 1% PenStrep ସହିତ ପରିପୂରକ) ରେ 24 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ କଲଚର କରାଯାଇଥିଲା: ଚିକିତ୍ସା ନକରି, 250 μM ଆଡେନୋସାଇନ୍ କିମ୍ବା 10 mM MNA ସହିତ ପରିପୂରକ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରାକ୍ ଚିକିତ୍ସା ପରେ, CAR-T କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ PBS ସହିତ ଧୋଇ 20,000 SK-OV-3 କୋଷ ସହିତ ମିଶ୍ରଣ କରାଯାଇଥିଲା [ATCC; McCoy 5A ମାଧ୍ୟମ (Sigma-Aldrich) ରେ 10% FBS ଏବଂ 10% PenStrep ସହିତ ପରିପୂରକ କରାଯାଇଥିଲା: ପରିପୂରକ ଇମ୍ୟୁନୋକଲ୍ଟ ମାଧ୍ୟମରେ 1 ର ପ୍ରଭାବକରୁ ଲକ୍ଷ୍ୟ ଅନୁପାତକୁ ତ୍ରିପ୍ରତିଲିପିରେ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା। ଡିଜିଟାଲିସ୍ ସାପୋନିନ୍ (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) ସହିତ ଲିଜ୍ କରାଯାଇଥିବା SK-OV-3 କୋଷ ଏବଂ SK-OV-3 କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ଯଥାକ୍ରମେ ନକାରାତ୍ମକ ଏବଂ ସକାରାତ୍ମକ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। 24 ଘଣ୍ଟାର ସହ-ଚାଷ ପରେ, ସୁପରନାଟାଣ୍ଟ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ନିର୍ମାତାଙ୍କ ନିର୍ଦ୍ଦେଶ ଅନୁସାରେ ଲାକ୍ଟେଟ୍ ଡିହାଇଡ୍ରୋଜେନେଜ୍ (LDH) ମାପ କରାଯାଇଥିଲା (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega)। LDH ସୁପରନାଟାଣ୍ଟକୁ LDH ବଫରରେ 1:50 ରେ ଦ୍ରବୀଭୂତ କରାଯାଇଥିଲା। ହତ୍ୟାର ପ୍ରତିଶତ ନିମ୍ନଲିଖିତ ସୂତ୍ର ବ୍ୟବହାର କରି ମାପ କରାଯାଇଥିଲା: ହତ୍ୟାର ପ୍ରତିଶତ = ସଂଶୋଧନର ପ୍ରତିଶତ / ସର୍ବାଧିକ ହତ୍ୟା ହାର x 100%, ଯେଉଁଠାରେ ସଂଶୋଧନର ପ୍ରତିଶତ = କେବଳ ସହ-ସଂସ୍କୃତି-T କୋଷ, ଏବଂ ସର୍ବାଧିକ ହତ୍ୟା ହାର = ସକାରାତ୍ମକ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ-ନକାରାତ୍ମକ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ।
ପାଠ୍ୟ କିମ୍ବା ସାମଗ୍ରୀ ଏବଂ ପଦ୍ଧତିରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ଅନୁସାରେ, ପରିସଂଖ୍ୟାନ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ GraphPad Prism 8, Microsoft Excel କିମ୍ବା R v3.6.0 ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ଯଦି ସମାନ ରୋଗୀଙ୍କଠାରୁ (ଯେପରିକି ascites ଏବଂ tumber) ଏକାଧିକ ନମୁନା ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଏ, ତେବେ ଆମେ ଏକ ଯୋଡା ଟି ପରୀକ୍ଷା ବ୍ୟବହାର କରୁ କିମ୍ବା ଉପଯୁକ୍ତ ଭାବରେ ଏକ ରେଖୀୟ କିମ୍ବା ସାଧାରଣୀକରଣ ମଡେଲରେ ଏକ ଅନିୟମିତ ପ୍ରଭାବ ଭାବରେ ରୋଗୀକୁ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରୁ। ମେଟାବୋଲୋମିକ୍ସ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ, ଗୁରୁତ୍ୱ ପରୀକ୍ଷା ତ୍ରିପ୍ରତିଲିପିରେ କରାଯାଏ।
ଏହି ଆର୍ଟିକିଲର ପରିପୂରକ ସାମଗ୍ରୀ ପାଇଁ, ଦୟାକରି http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 ଦେଖନ୍ତୁ।
ଏହା ଏକ ଖୋଲା ପ୍ରବେଶ ପ୍ରବନ୍ଧ ଯାହା କ୍ରିଏଟିଭ୍ କମନ୍ସ ଆଟ୍ରିବ୍ୟୁସନ୍-ଅଣ-ବାଣିଜ୍ୟିକ ଲାଇସେନ୍ସର ନିୟମାବଳୀ ଅଧୀନରେ ବଣ୍ଟନ କରାଯାଇଛି, ଯାହା ଯେକୌଣସି ମାଧ୍ୟମରେ ବ୍ୟବହାର, ବଣ୍ଟନ ଏବଂ ପୁନରୁତ୍ପାଦନକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ, ଯଦି ଶେଷ ବ୍ୟବହାର ବାଣିଜ୍ୟିକ ଲାଭ ପାଇଁ ନୁହେଁ ଏବଂ ମୂଳ କାର୍ଯ୍ୟ ସଠିକ୍ ବୋଲି ଆଧାରିତ। ସନ୍ଦର୍ଭ।
ଟିପ୍ପଣୀ: ଆମେ କେବଳ ଆପଣଙ୍କୁ ଆପଣଙ୍କର ଇମେଲ୍ ଠିକଣା ପ୍ରଦାନ କରିବାକୁ କହୁଛୁ ଯାହା ଦ୍ଵାରା ଆପଣ ପୃଷ୍ଠାକୁ ସୁପାରିଶ କରୁଥିବା ବ୍ୟକ୍ତି ଜାଣିପାରିବେ ଯେ ଆପଣ ତାଙ୍କୁ ଇମେଲ୍ ଦେଖିବାକୁ ଚାହୁଁଛନ୍ତି ଏବଂ ଏହା ସ୍ପାମ୍ ନୁହେଁ। ଆମେ କୌଣସି ଇମେଲ୍ ଠିକଣା କ୍ୟାପଚର କରିବୁ ନାହିଁ।
ଏହି ପ୍ରଶ୍ନଟି ଆପଣ ଜଣେ ପରିଦର୍ଶକ କି ନାହିଁ ତାହା ପରୀକ୍ଷା କରିବା ଏବଂ ସ୍ୱୟଂଚାଳିତ ସ୍ପାମ୍ ଦାଖଲକୁ ରୋକିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ।
ମରିସା କେ।
MNA ଟି କୋଷଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରତିରକ୍ଷା ଦମନରେ ଯୋଗଦାନ କରେ ଏବଂ ମାନବ କର୍କଟ ରୋଗର ଚିକିତ୍ସା ପାଇଁ ଏକ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଇମ୍ୟୁନୋଥେରାପି ଲକ୍ଷ୍ୟକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ।
ମରିସା କେ।
MNA ଟି କୋଷଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରତିରକ୍ଷା ଦମନରେ ଯୋଗଦାନ କରେ ଏବଂ ମାନବ କର୍କଟ ରୋଗର ଚିକିତ୍ସା ପାଇଁ ଏକ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଇମ୍ୟୁନୋଥେରାପି ଲକ୍ଷ୍ୟକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ।
© 2021 ଆମେରିକୀୟ ଆସୋସିଏସନ ପାଇଁ ବିଜ୍ଞାନର ଉନ୍ନତି ପାଇଁ | ସମସ୍ତ ଅଧିକାର ସଂରକ୍ଷିତ | AAAS ହେଉଛି HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ଏବଂ COUNTER ର ଅଂଶୀଦାର | ସାଇନ୍ସ ଆଡଭାନ୍ସ ISSN 2375-2548 |